共培養人臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs)和兔關節軟骨細胞誘導hUC-MSCs分化成軟骨細胞

羅二梅， 張家文，胡笑軻，唐明喬，宇 麗*

(暨南大學 1.醫學院 生物化學系； 2.理工學院 土木工程系， 廣東 廣州 510632)

研究論文

共培養人臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs)和兔關節軟骨細胞誘導hUC-MSCs分化成軟骨細胞

羅二梅1， 張家文1，胡笑軻1，唐明喬2*，宇 麗1*

(暨南大學 1.醫學院 生物化學系； 2.理工學院 土木工程系， 廣東 廣州 510632)

目的探討兔膝關節軟骨細胞和人臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs)的共培養對hUC-MSCs成軟骨誘導分化的影響及共培養的最佳比例。方法分離培養hUC-MSCs和兔膝關節軟骨細胞并鑒定其特異性。在Transwell體系中，按1∶4，1∶3，1∶2，1∶1，2∶1，3∶1及4∶1 的比例(hUC-MSCs：兔膝關節軟骨細胞)共培養。倒置相差顯微鏡觀察細胞的形態與增殖；甲苯胺藍染色及免疫熒光染色分別檢測葡萄糖胺聚糖(GAG)和Ⅱ型膠原(COL2A1)(蛋白水平定性)；并對各組細胞爬片進行GAG、COL2A1定量檢測；同時用實時定量熒光PCR(pPCR)檢測GAG、COL2A1 mRNA表達，觀察共培養前后細胞的基質分泌情況。結果共培養 21 d 后，陽性對照組和實驗組細胞甲苯胺藍染色及免疫熒光反應均呈陽性；GAG、COL2A1含量及mRNA表達量1∶4實驗組均要高于其他實驗組和陽性對照組。結論hUC-MSCs和兔關節軟骨細胞的共培養可明顯促進hUC-MSCs向軟骨樣細胞誘導分化，且最佳共培養比例為1∶4。

Transwell小室；人臍帶間充質干細胞；兔膝關節軟骨細胞；共培養；成軟骨誘導

近年來，細胞生物學和生物材料技術的高速發展使組織工程在軟骨缺損修復中的治療應用成為可能[1]。目前，軟骨細胞和間充質干細胞都被認為可用于構造新生軟骨組織。但軟骨細胞表型不易維持，容易去分化，因此，其臨床應用性受到限制。有研究表明，與軟骨細胞相比，人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell, hUC-MSCs)極易分離得到，且患者沒有創傷，因此是另一種重要的種子細胞來源[2-3]。傳統的誘導方法需要生長因子和(或者)基因運輸系統來促進細胞生長，費用高，難以有效應用于臨床，因此，共培養成為另一種新型的誘導方法[4]。受國外學者將Transwell小室用于促進內皮平滑肌細胞增殖及用于誘導分化成脂肪細胞等的啟發[5-6]，本實驗采用Transwell小室進行hUC-MSCs和兔膝關節軟骨細胞的相隔共培養，探討hUC-MSCs與兔膝關節軟骨細胞培養的最佳比例，為軟骨組織工程研究尋找一種新的種子細胞獲取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用新生兒臍帶(n=4)，取自暨南大學華僑醫學院，產婦體健，足月剖宮產，產婦及其家屬均簽署知情同意書，實驗方案經醫院醫學倫理會批準。新西蘭大白兔均由廣東省醫學實驗動物中心提供，3～4周齡，雄性，清潔型。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準[7]。主要試劑：膠原蛋白酶Ⅱ、胰蛋白酶、胰島素、轉鐵蛋白、甲苯胺藍和阿利新藍(Sigma公司)，維生素C(Amrersco公司)、T25培養瓶和Transwell小室(Corning公司)，成骨誘導試劑盒和成脂肪誘導試劑盒(CYAGEN公司)，DMEM/F12培養液、DMEM高糖培養液和胎牛血清(Gibco公司)，TGF-β1(PeproTech公司)，地塞米松，青霉素和鏈霉素(Hyclone公司)，總RNA提取試劑盒、反轉錄酶試劑盒和real-time PCR試劑盒(TIANGEN公司)，引物(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 hUC-MSCs的原代及傳代培養：無菌條件下，取臍帶3～5 cm，膠原蛋白酶Ⅱ消化，過濾，離心，收集細胞培養。待細胞長至80%～90%匯合時，消化離心后加入新的培養基置37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱繼續培養觀察細胞生長情況。

1.2.2 hUC-MSCs的表面標志物及hUC-MSCs誘導分化潛能檢測：已發表文章[8]。

1.2.3 兔膝關節軟骨細胞的原代及傳代培養：無菌條件下，取新西蘭大白兔(n=4)雙側膝關節軟骨，胰蛋白酶和膠原酶Ⅱ消化后過濾，離心，棄上清，收集軟骨細胞，接種于新的培養瓶。待細胞達到80%～90%匯合時，消化、傳代成第1代細胞，置37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱繼續培養。

1.2.4 hUC-MSCs和兔膝關節軟骨細胞共培養：取對數增殖期的第3代hUC-MSCs和第2代兔膝關節軟骨細胞，接種于放有多聚賴氨酸處理的無菌蓋玻片的Transwell共培養體系中，上室為兔膝關節軟骨細胞，下室為hUC-MSCs，按表1所示比例共培養。以單獨培養hUC-MSCs為陰性對照，以hUC-MSCs的基本軟骨誘導為陽性對照。待細胞長至80%～90%匯合時，陽性對照組加入成軟骨基本誘導培養基進行培養；實驗組用DMEM高糖溶液繼續培養；陰性對照組仍用DMEM/F12培養液進行培養。

表1 hUC-MSCs和兔關節軟骨細胞的共培養比例Table 1 Mixture ratio of hUC-MSCs and Rabbit articular chondrocytes

1.2.5 GAG和COL2A1的定性檢測：共培養21 d后，將細胞爬片沖洗1次，多聚甲醛固定，甲苯胺藍染色；PBS 沖洗至背景干凈，晾干，中性樹脂封片，觀察并拍照。共培養21d后，將細胞爬片洗2次，多聚甲醛固定，PBS洗3次，Triton X-100透膜處理，PBS洗3次，牛血清白蛋白(BSA)室溫濕盒封閉30 min。PBS洗2次，一抗4 ℃孵育過夜(溶度為1∶100)。PBS洗3次，二抗室溫避光孵育60 min(溶度為1∶64)。PBS洗3次，去離子水洗3次，熒光抗淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.6 GAG和COL2A1的定量檢測：收集共培養及基本軟骨誘導7、14和21 d的細胞培養液及細胞進行GAG和COL2A1的定量檢測。GAG定量采用阿利新藍法[9]。各組標本用木瓜蛋白酶消化，消化產物加入阿利新藍溶液后測定其吸光度值。羥脯氨酸測定試劑盒檢測COL2A1定量，按說明書進行，最后在酶標儀560nm波長處測定吸光度值。

1.2.7 定量PCR檢測GAG和COL2A1 mRNA表達：取第3代hUC-MSCs、共培養前后及誘導分化后的hUC-MSCs用real-time PCR試劑盒進行實時定量PCR 檢測。先提取總RNA，取1 μg總RNA用反轉錄酶試劑盒反轉錄為cDNA作為qPCR的模板。用GADPH作為內參。所有樣本的結果以GADPH的表達做相對定量分析。數據分析采用△△Ct方法[10]，相對表達量=2-ΔΔCt=2-(△Ct實驗組-△Ct對照組)=2-[(Ct實驗組-Ct內參) - (Ct對照組-Ct內參)]，數據取4次重復實驗的平均值。所使用引物序列見表2。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 hUC-MSCs表面標志物及誘導分化潛能的檢測

hUC-MSCs表面標志物的檢測及多向誘導分化潛能結果表明，我們所分離的干細胞為臍帶間充質干細胞，見已發表的文章[8]。

2.2 GAG和COL2A1的定性檢測

陽性對照組和實驗組的下室細胞(原hUC-MSCs)甲苯胺藍染色均強陽性，胞質及細胞外基質被染成紫藍色，而陰性對照組的下室細胞沒有著色 (圖1)。陰性對照組hUC-MSCs免疫熒光染色呈陰性表達，而陽性對照組和實驗組的下室細胞染色均強陽性，胞質及細胞外基質均呈現綠色熒光(圖1)。

2.3 GAG和COL2A1的定量檢測

誘導7、14和21 d后，陰性對照組(hUC-MSCs組)GAGA600 nm值在每個時間點都遠低于其他組(Plt;0.05)。實驗組1∶4，1∶3和1∶2 GAGA600 nm值明顯高于陽性對照組(hUC-MSCs基本誘導)，其中，又以1∶4組最顯著(Plt;0.05) (圖3A)。GAGA600 nm值隨著時間的延長而增加。誘導7、14和21 d后，陰性對照組(hUC-MSCs組)羥脯氨酸含量均低于其他組。實驗組1∶4，1∶3，和1∶2羥脯氨酸含量均高于陽性對照組(hUC-MSCs基本誘導)，其中，1∶4組第21天時羥脯氨酸含量最顯著(Plt;0.05)(圖3B)。羥脯氨酸含量隨時間的延長而增加。

2.4 實時定量PCR檢測GAG和COL2A1的mRNA表達

與陰性對照組相比，實驗組1∶4，1∶3和1∶2其GAGmRNA表達量均高于陽性對照組(Plt;0.05)。其中，1∶4 組在第21天時相對表達量最高 (Plt;0.05)(圖4A)。實驗組1∶4和1∶3COL2A1 mRNA表達量均高于陽性對照組(Plt;0.05)。同樣，1∶4組在第21天時相對表達量最高(Plt;0.05)(圖4B)。GAG和COL2A1 mRNA的相對表達量均隨時間的延長而增加。

表2 GAG和COL2A的實時定量PCR引物序列Table 2 Real-time quantitative PCR primer sequence of human GAG and COL2A1

A.hUC-MSCs; B.the basic induction of hUC-MSCs; C.1∶4; D.1∶3; E.1∶2; F.1∶1; G.2∶1; H.3∶1; I.4∶1圖1 共培養21 d后甲苯胺藍染色結果Fig 1 The result of Toluidine blue staining after cocutturing for 21 days(×10)

A.hUC-MSCs; B.the basic induction of hUC-MSCs; C.1∶4; D.1∶3; E.1∶2; F.1∶1; G.2∶1; H.3∶1; I.4∶1圖2 共培養21 d后免疫熒光鑒定結果Fig 2 The result of immunofluorescece staining of coculturing for 21 days(×100)

3 討論

本研究的hUC-MSCs通過Ⅱ型膠原酶消化臍帶得到，高表達CD29、CD44和CD105，而其CD31、CD34、CD40、CD45和HLA-DR均低表達或不表達，且前期的流式細胞儀檢測周期結果顯示[8]，大部分hUC-MSCs處于G0/G1期，其余hUC-MSCs均處于增殖分裂期，說明hUC-MSCs處于為分化的狀態。茜素紅染色、油紅O染色以及Alcian blue 染色進一步說明hUC-MSCs具有向成骨、成脂肪和成軟骨誘導分化的能力，和骨髓來源的間充質干細胞一致，符合間充質干細胞的特性[11]。

軟骨細胞具有分泌作用，可分泌骨形態蛋白、堿性成纖維細胞生長因子、血小板衍生生長因子、胰島素樣生長因子等[12]。早有文獻報道，其分泌的細胞因子可以促進間充質干細胞向成軟骨細胞誘導分化[13]。本實驗將兔膝關節軟骨細胞與hUC-MSCs共培養，結果顯示實驗組上層細胞Alcian blue染色和甲苯胺藍染色檢測成陽性，提示實驗組上層細胞能夠分泌成軟骨細胞特異性表達，證實是軟骨細胞。

本實驗引進Transwell膜、通過Transwell小室實現軟骨細胞與hUC-MSCs的共培養。Transwell膜，聚酯材料，孔徑≤3.0 μm，這種膜允許生物大分子自由通過膜的微孔隙，而細胞不可能通過膜的微孔隙，而且選用的聚酯膜為鏡下透明膜，故對鏡下的直接觀察不產生影響[7-8]。所以Transwell膜的引進，完全可以實現關節軟骨細胞與hUC-MSCs的共培養，又可以清晰、明了、簡單地獲取實驗結果。

A.the quantitative detection of the content of glycosaminoglycan; B.the quantitative detection of the content of hyelroxy proline;*Plt;0.05 compared with the basic induction group (positive group)

A.the expression level of GAG; B.the expression level of COL2A1;*Plt;0.05 compared with the basic induction group (positive group)

在本研究中，甲苯胺藍染色和免疫熒光染色表明各實驗組中均有GAG和COL2A1的分。GAG和COL2A1為軟骨細胞特異性細胞外基質，兩者的存在說明有成軟骨樣細胞的產生。GAG和COL2A1的含量檢測結果顯示，實驗組1∶4其GAG和COL2A1的含量顯著高于陽性對照組和其他實驗組。qPCR檢測軟骨細胞GAG、COL2A1 mRNA的表達，提示實驗組與陽性對照組細胞GAG、COL2A1表達成陽性，進一步證實實驗組hUC-MSCs已向軟骨細胞轉化，實驗組1∶4的GAG、COL2A1含量顯著高于陰性對照組。

綜上所述，一定比例的Transwell 共培養可明顯增強hUC-MSCs的成軟骨誘導分化的能力。而且，從本研究中可知hUC-MSCs與兔膝關節軟骨細胞的最佳Transwell 共培養比例為1∶4。但hUC-MSCs分化為軟骨細胞的具體機制還需進一步研究。

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Human umbilical cord mesenchymal stem cells are inducedto differentiate into chondrocytes by co-culture with rabbit chondrocytes

LUO Er-mei1, ZHANG Jia-wen1, HU Xiao-ke1, TANG Ming-qiao2*, YU Li1*

(1.Dept. of Biochemistry, Medical College;2.Dept.of Civil Engineering College of Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

ObjectiveTo determine if the co-culture of rabbit articular chondrocytes and hUC-MSCsinvitrocan affect differentiation of hUC-MSCs into cartilage-like cells, especially chondrocytes, and if so, what the optimal ratio of the two cell types is.MethodsTo co-culture rabbit articular chondrocytes and hUC-MSCs at a chondrocyte: hUC-MSCs ratio of 4∶1, 3∶1, 2∶1, 1∶1, 1∶2, 1∶3,1∶4 for 21 days and cultured in DMEM high glucose medium. Type Ⅱcollagen (COL2A1) and glycosaminoglycan (GAG) were analyzed qualitatively by toluidine blue and immunofluorescence technique, respectively. The contents of COL2A1 and GAG were estimated from the determination of hydroxyproline content and Alcian Blue method separately. The mRNA expressions ofGAGandCOL2A1 were assayed by real-time fluorescence quantitative PCR.ResultsThe expression ofCOL2A1 andGAGon day 21 was much higher in the 4∶1, 2∶1, and 1∶1 groups than in other the experimental group or the induced hUC-MSCs group. Also on day 21, the expression of COL2A1 and GAG proteins in the 4∶1 group was much higher than that in all other groups.ConclusionsThe optimal cell ratio in Transwell co-culture system appears to be 1∶4 (hUC-MSCs:chondrocytes).

transwell co-culture system; human umbilical cord mesenchymal stem cells; rabbit knee articular chondrocytes; co-culture; chondrogenic induction

2013-03-08

2013-06-17

廣東省自然科學基金(9151008901000050)

*通信作者(correspondingauthor)： doctoryuli@yahoo.com.cn; tmqtmq@jnu.edu.cn

1001-6325(2014)01-0082-06

Q 254

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