JAK2/STAT3通路參與大鼠坐骨神經結扎神經病理性疼痛模型

薛照靜，申 樂，王之遙，黃宇光

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 麻醉科，北京 100730)

研究論文

JAK2/STAT3通路參與大鼠坐骨神經結扎神經病理性疼痛模型

薛照靜，申 樂，王之遙，黃宇光*

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 麻醉科，北京 100730)

目的結扎大鼠雙側坐骨神經復制bCCI模型，觀察JAK2/STAT3通路的激活情況。方法60只體質量180～200 g SD雌性大鼠隨機分為3組, bCCI組，sham組及Na?ve組。分別于bCCI手術術前1 d，術后3、7、14和21 d取腰段脊髓背角，并進行RT-PCR及Western blot觀察通路中主要因子的mRNA 水平及蛋白水平的變化。結果bCCI組大鼠對機械、熱刺激及冷丙酮刺激的痛覺閾值明顯降低。與sham組及Na?ve相比，bCCI組STAT3、SOCS3、JAK2及IL-6 mRNA水平顯著升高，且3組在不同時間點具有差異(Plt;0.05)。與sham組及Na?ve相比，bCCI組P-STAT3、JAK2和SOCS3蛋白水平升高。結論大鼠bCCI神經病理性疼痛模型JAK2/STAT3通路激活。

JAK2；STAT3；神經病理性疼痛

神經病理性疼痛是由神經系統原發性損害和功能障礙所激發或引起的疼痛，由于機制復雜，在臨床醫療中是一個巨大的挑戰。神經系統與免疫系統之間的相互作用，為治療神經病理性疼痛提供了新的靶點。JAK(janus kinase，JAK)/STAT(signal transducers and activators of transcription，STAT)信號通路是近年來發現的一條由細胞因子刺激的信號傳導通路，在中樞神經系統中，JAK2/STAT3通路在抑制炎性反應、腫瘤[1]及神經退行性變[2]、神經病理性疼痛中發揮重要作用。目前的研究認為，STAT分子家族，尤其是STAT3在免疫調節及應激中占有重要作用。因此，通過對JAK/STAT通路在神經病理性疼痛中的作用的研究，希望能了解神經病理性疼痛的分子機制進而為神經病理性疼痛提供新的治療方案。

1 材料與方法

1.1 動物實驗及分組

SPF級SD雌性大鼠，180～200 g,室溫22 ℃左右,相對濕度50%左右,明暗各12 h，自由攝水和食物, 每日更換籠具和墊料。大鼠由北京動物研究所 [許可證SCXK(京)：20022003] 提供，飼養于北京協和醫院實驗動物中心。適應環境3～5 d后手術。

按照隨機數字表法將大鼠隨機分為bCCI組，sham組及Na?ve組(n=60)。bCCI組進行雙側坐骨神經結扎。腹腔注射戊巴比妥40～50 mg/kg，在距坐骨神經起始處上方2 mm用4.0含鉻羊腸線結扎坐骨神經4道，每道間隔約1 mm。間斷縫合；sham組進行坐骨神經暴露但不進行手術結扎,其余同模型組；Na?ve組僅保證相同的飼養時期；手術由同一人操作。對側同樣。

1.2 動物行為學方法

分別于bCCI模型手術前1 d，術后3、7、14和21 d進行動物行為學測量。測定間隔為3 min，每只左右后足重復測量3次，將3次讀數取平均值為痛閾值。

1.2.1 機械刺激誘發痛測定：采用電子von Frey測痛儀測定[3]。安靜的適應環境10～30 min。用金屬探頭垂直刺激大鼠后腳底。記錄儀自動記錄使大鼠產生縮足反射的最小刺激強度。3次平均值作為機械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)。

1.2.2 熱刺激誘發痛測定：采用BME-410A熱照射疼痛刺激儀測定。安靜的適應環境10～30 min。用熱測痛儀照射大鼠左、右后腳底，待大鼠產生快速縮足、揚足或添足后停止照射，記錄下照射持續時間即為縮足反射的潛伏期(paw withdrawal thermal latency，PWTL)。將3次讀數取平均值作為熱刺激傷害感受閾，最高閾值設為20 s。

1.2.3 冷刺激誘發痛測定[4]：大鼠適應環境15 min分鐘后，將0.1 mL丙酮滴加在大鼠的后足上。記錄1 min內大鼠出現抬足、縮足、快速甩足以及甩足后舔足等陽性表現的次數，間隔3 min重復。每只后足重復3次。次數作為冷痛閾值(total number of withdrawal)。

1.2.4 處死動物及取材：深度麻醉后斷頭處死大鼠。俯臥位，迅速暴露脊髓，小心取出腰膨大，切除脊髓背角，立即放入液氮冷卻5～10 min后放入-80 ℃冰箱保存。

1.3 RT-PCR(real time -PCR)

Trizol法進行提取RNA。紫外分光光度儀測定RNA濃度與質量鑒定。每個RNA樣本的OA260/OA280值要求在1.8～2.1之間則可以認為RNA的純度較好，否則棄之不用。RT-PCR反應采用TAKARA反轉錄及RT-PCR試劑盒。條件合格的RNA樣本按照PrimeScriptTMRT Master Mix(Takara DRR036A)說明加入試劑行反轉錄反應合成CDNA。RT-PCR選用GAPDH基因做為內參，引物設計運用Primer Premier5.0和Oligo 6軟件進行引物設計， 各基因引物設計(表1)。cDNA模板按照SYBRPremix ExTaqTMII(Takara RR820A)說明進行RT-PCR反應，每個樣品同時做3個復管。AB Applied Biosystems Step-one plus進行RT-PCR反應。PCR結束后根據熔解曲線確定產物的特異性并采用2-ΔΔCT法計算基因表達量。

表1 RT-PCR目的基因引物序列

1.4 Western blot

組織塊破碎后(冰上操作)，加RIPA(單去污劑)裂解液裂(含蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑)勻漿。使用BCA法，通過微孔酶標儀制作標準曲線測定蛋白濃度。按照分子質量大小選擇配8%或12%分離膠，取40 μg樣品上樣，用彩染蛋白分子量指示標準SDS-PAGE膠(10 cm×10 cm)。80 V電壓電泳直到跑出濃縮膠，120 V電壓直至蛋白指示劑移動到膠的底部。300 mA恒流轉膜75 min，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h?？贵w(CST及Santa Cruze公司)?？筽STAT3抗體(1∶500),抗STAT3抗體(Tyr705,1∶500),抗 SOCS3 抗體(1∶100),抗JAK2抗體(1∶500)4 ℃過夜。TBST清洗3遍，二抗孵育，輕度震蕩，室溫1 h。ImageQuant LAS 4000mini進行儀器曝光。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 動物行為學變化

各組術前及術后各時間點，左右側后足痛閾無差異，選擇左右平均值作為每個時間的閾值水平。Na?ve組與sham組相比，MWT，PMWT及對丙酮冷刺激在術前與術后各時間點無差異(圖1)。

2.1.1 大鼠機械刺激縮足反射閾值(MWT)的變化：術后第7天開始至21天，bCCI組雙后足機械性痛閾較術前及正常對照組、假手術組顯著下降 (Plt;0.05)，并在術后第14天達到最低點。

2.1.2 大鼠熱反射閾值(PMWT)的變化：術后第7天開始至21天，bCCI組左后足熱刺激傷害感受閾閾值較術前及正常對照組、假手術組顯著下降(Plt;0.05)，并在術后第14天達到最低點。

2.1.3 大鼠對冷丙酮刺激縮足反應的變化：術后第7天起bCCI大鼠的陽性反應次數即顯著多于術前(Plt;0.05)。

2.2 RT-PCR結果(圖2)

2.2.1STAT3 mRNA：與sham組相比，在bCCI組STAT3 mRNA有明顯升高(Plt;0.05)，于第14天達到高峰；與Na?ve組相比，升高4.98倍(Plt;0.05)。

2.2.2SOCS3 mRNA：與sham組相比，bCCI組SOCS3 mRNA水平明顯升高(Plt;0.05)，與Na?ve組相比，升高10.8倍(Plt;0.05)。

2.2.3JAK2 mRNA:與sham組相比，bCCI組JAK2 mRNA于第14天顯著升高(Plt;0.05)；與Na?ve組相比，升高1.92倍(Plt;0.05)。

*Plt;0.05 compared with sham圖1 bCCI組、sham組及Na?ve組大鼠后足對不同刺激的行為學變化趨勢

*Plt;0.05 compared with sham圖2 目的基因SOCS3、STAT3、IL-6和JAK2 mRNA變化

2.2.4IL-6 mRNA：3 dIL-6 mRNA水平升高，之后下降，與sham組相比，至術后21 dIL-6 mRNA再次升高(Plt;0.05)；與Na?ve組相比，升高6.15倍(Plt;0.05)。

2.3 Western blot 結果(圖3)

2.3.1 P-STAT3：與sham組及Na?ve相比，bCCI組P-STAT3蛋白水平無顯著升高。

2.3.2 STAT3：與sham組及Na?ve相比，bCCI組STAT3蛋白水平無顯著變化。

2.3.3 JAK2：與sham組及Na?ve相比，bCCI組JAK2蛋白水平無明顯升高。

2.3.4 SOCS：與sham組及Na?ve相比，bCCI組SOCS3蛋白水平無明顯升高。

3 討論

本研究發現JAK2/STAT3 通路在大鼠bCCI神經病理性疼痛模型中是激活的，與研究假設相符。

單側坐骨神經結扎模型(uCCI)，大鼠術側重量與非手術側重量隨時間變化逐漸失衡，對刺激的敏感度出現差異，會造成結果的失真。bCCI則避免了這一誤差。各組各點左后足與右后足變化水平及趨勢基本一致。術后第7天開始至21天，bCCI組雙后足痛閾較術前及sham組、Na?ve組顯著下降，并在術后第14天達到最低點。研究采用雌性、小質量鼠是由于它們對疼痛更為敏感。

本研究發現在mRNA 水平及蛋白水平，JAK2及STAT3均出現升高，其中，JAK2于14 d有顯著升高，并且疼痛行為學相一致，表明大鼠bCCI中JAK2/STAT3通路激活，可能與神經病理性疼痛的發生與維持相關。脊髓損傷模型后同樣發現STAT3的激活對軸突的再生起著促進作用[5]。結扎脊神經(SNL)后脊髓背角小膠質細胞中的STAT3磷酸化[6]，脊髓束半橫斷損傷模型同樣發現JAK2及STAT3的激活[7]，說明STAT3的激活在疼痛模型中發揮重要作用。但是其時間趨勢與本研究不同。這可能與單側模型，取材精確度可能受對側脊髓的干擾導致結果偏差相關。也可能與模型導致機體對刺激的反應過程不同相關。

SOCS基因表達通常為陰性，受到刺激后快速合成， SOCS蛋白結合磷酸化JAK，抑制下游通路的激活，參與JAK/STAT通路的負反饋調節。本研究發現，bCCI組SOCS3 mRNA明顯升高。SOCS3蛋白表達先上升后下降，這可能由于手術急性損傷導致，之后通路出現負反饋，使蛋白的表達出現下降。SNL模型同樣發現L5～L6脊髓背根神經節會激活SOCS3 mRNA的表達[6]。

圖3 SOCS3、STAT3、P-STAT3和JAK2 mRNA的Western blot結果

本研究發現IL-6 mRNA先升高，后下降，于21 dIL-6 mRNA顯著升高。這可能與bCCI大鼠行為學表現在14 d疼痛達到高峰，機體會產生二次應激，從而導致IL-6在21 d再次升高有關。大鼠CCI模型L4～L5脊髓背角神經元IL-6激活[8]， SNL后L5～L6脊髓背根神經節IL-6 mRNA表達同樣明顯升高[6]。

近年來，銀杏肉堿B[9]和雷公藤[10]發揮神經保護作用均由JAK2/STAT3通路介導的，提示JAK2/STAT3通路抑制劑可能在治療神經病理性疼痛中有一定的潛力。因此，下一步將嘗試探求JAK2/STAT3抑制劑對神經病理性疼痛的影響。對JAK/STAT信號通路的進一步認識，如STAT1[11]，也可為神經病理性疼痛的有效治療提供新靶點。

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JAK2/STAT3 pathway is involvedin bilateral chronic constriction injury rat neuropathic pain model

XUE Zhao-jing, SHEN Le，WANG Zhi-yao, HUANG Yu-guang*

(Dept. of Anesthesiology, PUMC Hospital, CAMS amp; PUMC，Beijing 100730，China)

ObjectiveTo evaluate the contribution of the JAK2/STAT3 pathway to neuropathic pain by animal model.MethodsA rat model of bCCI was established and 60 rats’ behavior tests were performed on the day before surgery and on day 3,7,4 and 21 after surgery, L4～L6 dorsal spinal cord was harvested at the each time point. RT-PCR and Western blot were performed to explore the activation of JAK2/STAT3 pathway.ResultsPain-related behavioral tests socres in the bCCI rats were significant decreased as compared to the sham-operated and na?ve group at each time point postoperatively (Plt;0.05).SOCS3 mRNA andSTAT3 mRNA significantly increased on day 14, accompanied byJAK2 mRNA of with a similar time course.IL-6 mRNA level increased on day 3 and showed statistically significant increases on day 21. Western blot analysis showed that JAK2, P-STAT3, SOCS3 increased at different timepoints.ConclusionOur results suggest that the JAK2/STAT3 pathway in the spinal dorsal horn was significantly upregulated in a rat bCCI model of neuropathic pain which will open new avenues for therapeutic intervention.

JAK2；STAT3；neurpathic pain

2013-10-08

2013-11-14

國家自然科學基金 (31070930)；國家自然科學基金青年課題(81200869)

*通信作者(correspondingauthor): garybeijing@163.com

1001-6325(2014)01-0062-06

R 164

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