重組siRARγ腺病毒構建及其對小鼠肝臟祖細胞分化的影響

周建武，何 昀，龔夢嘉，畢 楊

(重慶醫科大學附屬兒童醫院兒研所干細胞實驗室兒童發育疾病研究教育部重點實驗室重慶市干細胞治療工程技術研究中心，重慶400014)

全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)是維生素A 在體內的重要活性形式，在胚胎發育，組織器官形成，細胞的增殖分化，腫瘤的發生發展中具有重要的作用［1］。全反式維甲酸主要通過與維甲酸核受體(α、β、γ 3 種亞型)結合激活維甲酸信號傳導途徑，參與下游靶基因的轉錄調控，發揮維持機體正常生理穩態的生物學作用［2］。維甲酸核受體γ 是研究相對較少的一種亞型，主要與皮膚的發生、生長、分化及免疫細胞功能調節相關［3－4］，目前RARγ 與肝臟相關疾病的研究較少，僅有少數報道顯示與脂肪代謝和肝腫瘤的發生有關［5－6］。

前期結果表明，ATRA 對小鼠胚胎肝臟祖細胞的成熟分化有很強的誘導作用，而在小鼠肝臟發育過程中，胚胎期RARγ 的表達較低，但是在出生后呈現非常明顯的上調趨勢［7］，提示RARγ 在肝細胞成熟分化過程中的重要作用。本實驗采用Ad-easy 腺病毒系統，成功構建并篩選出能有效抑制RARγ 表達的siRNA 腺病毒，并在體外探討RARγ 抑制對ATRA 誘導肝細胞成熟分化的影響，為研究維甲酸信號傳導途徑調控肝臟正常發育及肝腫瘤的發生發展奠定了重要基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

Ad-easy 腺病毒系統(包括穿梭質粒pSESHUS，攜帶腺病毒骨架質粒pAdEasy-1 的大腸桿菌BJ5183(由美國芝加哥大學何通川教授饋贈);來自于胚胎期14.5 d的小鼠胚胎肝臟祖細胞(Hepatic progenitor cells HP 14.5 d)由本實驗室分離構建［5］;DH5α 大腸桿菌、HEK293 細胞系、pALB-GLuc 質粒為本實驗室保存;內切酶Sfi Ⅰ、Pme Ⅰ、Pac Ⅰ，Gaussia luciferase 檢測試劑盒(NEB 公司);內切酶Kpn Ⅰ、EcoR Ⅴ，T4DNA 連接酶和RT-PCR 試劑盒(TAKARA 公司);2 ×PCR Premix(東勝生物公司);總RNA 提取試劑盒、質粒小抽試劑盒(Promega 公司)，LipofectamineTM2000、1 Kb Plus DNA Ladder(Invitrogen 公司);2 ×SYBR Green 反應液(天根生物公司);DMEM 培養基、胎牛血清(Gibco 公司);兔抗小鼠RARγ 多克隆抗體、兔抗小鼠β-actin 單克隆抗體、HRP 標記的羊抗兔二抗(Santa cruz 公司);PCR引物由華大基因公司合成，基因測序在重慶醫科大學感染病重點實驗室完成。

1.2 方法

1.2.1 重組腺病毒質粒pAd-siRARγ 的構建:采用SiDESIGN 軟件設計3 對特異性針對小鼠RARγ 的siRNA 序列(表1)，體外退火(10 mmol/L正義鏈和反義鏈DNA 片段各10 μL混合，100 ℃，10 min，自然冷卻至室溫)形成兩端帶有Sfi Ⅰ黏性末端的雙鏈DNA，與經Sfi Ⅰ酶切純化后的pSES-HUS 質粒16 ℃連接過夜，電轉DH5α 大腸桿菌感受態，卡那霉素抗性LB 平板上篩選單克隆菌落，搖菌提質粒，PCR(反應體系20 μL:2 μL質粒模板，330 mg/L siRNA反義鏈和U6 啟動子引物各0.5 μL，2 ×PCR premix 10 μL，加水至20 μL;PCR 參數:94 ℃2 min;94 ℃20 s，56 ℃20 s，72 ℃20 s，30 循環;72 ℃2 min)及Kpn Ⅰ和EcoR Ⅴ雙酶切鑒定后送測序，獲得3 組pSES-siRARγ 重組腺病毒穿梭質粒。經Pme Ⅰ酶切(50 μL體系:10 ×NEB 緩沖液5 μL，100 ×牛血清白蛋白0.5 μL，Pme Ⅰ1 μL，質粒2 μg，加水至50 μL，37 ℃6 ～8 h)線性化后與pAdEasy-1 骨架質粒轉化入至BJ5183 感受態細胞內進行同源重組，卡那霉素和鏈霉素篩選，PCR(引物及參數同前)和Pac Ⅰ酶切(50 μL體系:10 ×NEB 緩沖液5 μL，100 ×牛血清白蛋白0.5 μL，Pac Ⅰ1 μL，質粒2 μg，加水至50 μL，37 ℃6 ～8 h)鑒定獲得重組腺病毒質粒pAd-siRARγ。

表1 小鼠RARγ 的siRNA 序列Table 1 Sequences of siRNA for mouse RARγ

1.2.2 HEK293 細胞中包裝重組腺病毒AdsiRARγ:pAd-siRARγ 質粒Pac Ⅰ酶切線性化備用，HEK293 細胞種植于底面積25 cm2的培養瓶中過夜，匯合度達70% ～80%時用LipofectamineTM2000轉染質粒。24 h后觀察紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)的表達，之后每3 天觀察RFP 的表達變化及細胞病毒空斑狀態。10 ～14 d后，1/2以上細胞變圓漂浮時收集細胞，0.5 mL PBS 重懸，－80 ℃速凍，37 ℃復融共4 次，離心收集病毒上清，多次感染HEK293 細胞獲得高滴度病毒。

1.2.3 重組腺病毒滴度及感染復數的檢測:96 孔板，每孔接種293 細胞104個，孵箱培養24 h。將待測病毒用DMEM 全培養基稀釋至10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9和10－10稀釋度。吸去上清，分別加入每個稀釋度的病毒液體，每孔200 μL，每種樣本均作復孔，同時設培養基對照(不含腺病毒)。孵育36 ～48 h。鏡下觀察細胞病變效應，計算病毒滴度。病毒滴度計算公式:病毒滴度(PFU/mL)=RFP 陽性細胞數×病毒稀釋倍數(PFU)/稀釋后體積(mL)。小鼠HP 14.5 d 細胞按2 ×105細胞/孔接種于6 孔板，Ad-siRARγ 腺病毒感染細胞，同時設置Ad-RFP 對照組，每種病毒設10、20、40 和80 4 個感染復數(MOI:病毒PFU/細胞數)，48 h后計數RFP 陽性細胞百分率，以50% ～60%RFP 陽性細胞孔為該病毒的最佳MOI。

1.2.4 Real-time PCR 及Western blot 篩選能有效抑制小鼠HP 14.5 d 細胞中RARγ 表達的AdsiRARγ:選擇最佳MOI 孔，在病毒感染3 d后提取細胞總mRNA，RT-PCR 反轉錄成cDNA，real-time PCR檢測RARγ(上游:5'-GACCCAGCCAACCCTACAT-3'，下游:5'-ACATCTCCGGGTTCTCCAG-3')的表達(PCR 反應體系20 μL:2 μL cDNA 模板，330 mg/L引物各0.5 μL，2 ×SYBR Green 反應液10 μL，加水至20 μL;PCR 參數:94 ℃3 min;94 ℃10 s，54 ℃20 s，72 ℃20 s，40 循環;溶解曲線65 ℃～95 ℃每5 s增加0.5 ℃，讀板)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(上游:5'-GGCTGCCCAGAACATCAT-3'，下游:5'-CGGA CACATTGGGGGTAG-3'，PCR 參數同上)為內參標化各組cDNA 模板。同上設置各處理組，提取細胞總蛋白，等量蛋白進行10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳(120 V，2 h)，轉移至PVDF 膜(80 V，1 h)。用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入抗RARγ(1∶200)或抗β-actin(1∶500)一抗，4 ℃過夜;TBST 洗膜3 次，加入HRP 標記的二抗(1∶500)，室溫1 ～2 h，洗膜，ECL 發光，用Image Pro Plus 6.0 軟件分析吸收光度值。

1.2.5 ALB-Gluc 活性檢測Ad-siRARγ 對ATRA 誘導小鼠胚胎肝臟祖細胞成熟分化的影響:小鼠HP 14.5 d細胞按5 ×104細胞/孔接種于24 孔板，設置復孔，pBGLuc-ALB 質粒轉染細胞。24 h后Ad-RFP、Ad-siRARγ2、Ad-siRARγ3 以最佳感染復數感染細胞，48 h后加入1 μmol/L ATRA，隨后每3 天檢測培養上清中分泌的ALB-Gluc 活性。取各孔培養上清20 μL，放入1.5 mL EP 管中，加入新鮮配置的底物反應液10 μL(反應緩沖液∶底物=100∶1)，快速混合后立即置于多功能檢測儀下讀數。

1.2.6 PAS 染色檢測Ad-siRARγ 對ATRA 誘導的小鼠胚胎肝臟祖細胞功能的影響:小鼠HP 14.5 d細胞按5 ×104細胞/孔接種于24 孔板，設置復孔，Ad-RFP、Ad-siRARγ1、Ad-siRARγ3 以最佳感染復數感染細胞，48 h后加入1 μmol/L ATRA 誘導，12 d后進行檢測。吸棄培養液，每孔加入400 μL 4%多聚甲醛，固定10 min，PBS 洗滌3 次。加入400 μL 0.5%高碘酸試劑，室溫孵育5 min，PBS 洗滌3 次;加入400 μL席夫堿試劑，孵育15 min，流水沖洗2 ～3 min;加入100 μL蘇木精復染細胞1 ～2 min，流水沖洗直至澄清，以上操作均在室溫完成。置于倒置顯微鏡下觀察，選取10 個不重復視野，計數陽性細胞比例。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 pAd-siRARγ 重組腺病毒質粒的構建

RT-PCR 擴增重組腺病毒質粒pAd-siRARγ，可擴增出約300 bp 的條帶(圖1)。正確重組的質粒由于siRNA 片段插入后丟失EcoR Ⅴ酶切位點，Kpn Ⅰ及EcoR Ⅴ雙酶切無1 798 bp 的短片段(圖2)。各組隨機選擇一個質粒測序，結果與所設計的siRNA 序列完全一致。同源重組后的pAd-siRARγ同樣可PCR 擴增出300 bp的DNA 片段(圖3A)，Pac Ⅰ酶切獲得4 500 bp 的特征性小片段和大于30 kb的大片段(圖3B)。

2.2 HEK293 細胞中包裝重組腺病毒Ad-siRARγ

pAd-siRARγ 質粒轉染HEK293 細胞，24 h可觀察到約10% ～20%的RFP 陽性細胞，10 d左右可見云霧狀擴增的RFP 陽性細胞，最終得到的病毒滴度為2.0 ×108、4.3 ×108和3.7 ×108PFU/mL的重組腺病毒Ad-siRARγ1、2 及3。MOI 分別為40、20 和20時，對小鼠HP 14.5 d細胞的48 h感染率為60% ～70%(圖4)。

圖1 pSES-siRARγ 重組腺病毒穿梭質粒PCR 電泳圖Fig 1 PCR products amplified from recombination shuttle plasmid pSES-siRARγ

圖2 Kpn Ⅰ和EcoR Ⅴ雙酶切pSES-siRARγ 重組腺病毒穿梭質粒Fig 2 Recombination shuttle plasmid pSES-siRARγ plasmids were digested by restriction endonuclease Kpn Ⅰand EcoR Ⅴ

2.3 Ad-siRARγ 能有效感染小鼠HP14.5 細胞并抑制RARγ 的表達

Ad-siRARγ1、Ad-siRARγ2 和Ad-siRARγ3 對小鼠HP14.5 細胞中RARγ 的抑制效率分別為3.7%、68.9%、59.7%，后兩組RARγ 的表達顯著低于對照組(P＜0.05)(圖5)。各組蛋白量一致的情況下，Ad-siRARγ1 組的RARγ 表達與Ad-RFP 對照組相比無明顯差異，而Ad-siRARγ2、Ad-siRARγ 可顯著降低RARγ 的表達(圖6)。

2.4 Ad-siRARγ 能抑制 ATRA 誘導的小鼠HP14.5 細胞的分化及功能

圖3 pAd-siRARγ 重組腺病毒質粒鑒定Fig 3 Identification of three pairs of pAd-siRARγ adenovirus recombinant

圖4 腺病毒Ad-siRARγ 在HEK293 細胞中包裝及感染小鼠HP 14.5 d 細胞Fig 4 Package of Ad-siRARγ in HEK293 cells and infection of mouse HP 14.5 d cells (take Ad-siRARγ1 as example)

圖5 Real-time PCR 檢測不同處理組RARγ 的mRNA 水平表達Fig 5 The mRNA expression level of RARγ in each treated groups was detected by real-time PCR

圖6 Western blot 檢測不同處理組RARγ 的蛋白水平表達Fig 6 The protein expression level of RARγ in each treated groups was detected by Western blot

選取能有效抑制RARγ 表達的Ad-siRARγ2、3進行后續實驗。ATRA 能促進小鼠HP14.5d 細胞的成熟分化，ALB-GLuc 的活性顯著高于未誘導組，而Ad-siRARγ2、3 能明顯下調ATRA 誘導的ALB-GLuc活性(P＜0.05)(圖7)。成熟的肝細胞具有合成糖原的能力，經PAS 染色可在胞質中呈現紫紅色顆粒，ATRA 誘導組的PAS 染色陽性細胞率49.8% ±5.8%遠高于未處理組5.2% ±2.1%(P＜0.05)，而Ad-siRARγ2、3 抑制RARγ 表達后，ATRA 誘導的PAS 陽性率分別降至(21.6% ± 4.7%、23.6% ±2.4%(P＜0.05)(圖8)。

圖7 Ad-siRARγ 對ATRA 體外誘導小鼠HP 14.5d細胞ALB-GLuc 活性的影響Fig 7 The effect of Ad-siRARγ on ATRA induced ALB-GLuc activity of mouse HP14.5 cells

圖8 Ad-siRARγ 抑制ATRA 誘導的小鼠HP14.5d 細胞糖原合成能力的PAS 染色結果Fig 8 PAS staining was performed to detect the inhibition of Ad-siRARγ on glycogen storage function of ATRA induced mouse HP14.5 cells (×200)(scale bar=200 μm)(indicated by black arrow)

3 討論

維甲酸(retinoic acid，RA)是維生素A 在體內的重要活性代謝產物，ATRA、13-順式維甲酸(13-cis-RA)和9-順式維甲酸(9-cis-RA)，可介導機體內細胞的分化、增殖、凋亡和免疫調節等多種生物學功能［8］。RA 可調控肝代謝相關基因的表達，參與胰島素抵抗，用于治療非酒精性脂肪肝［9－10］。RA 與肝臟內胚層的發育密切相關，在胚胎期可通過wnt 2bb 基因誘導肝臟特化［11］，能使體外培養的去分化成體肝細胞恢復正常的形態結構，也能誘導其他來源的干細胞向肝細胞方向分化。通過前期實驗證明，小鼠胚胎肝臟前體細胞在ATRA和9-cis RA 的作用下，肝細胞相關因子的表達增高并逐漸出現糖原合成及ICG 攝取的成熟肝細胞功能，且兩者具有協同刺激肝細胞分化作用［4］。

目前認為RA 受體有兩類:RAR(retinoic acid receptor)和RXR(retinoic acid X receptor)，均包含由不同基因編碼的α、β 與γ 3 個亞類。ATRA 和9-cis-RA都可以活化RARs，而只有9-cis-RA 能活化RXRs［12］。在前期實驗中，檢測了RA 信號分子在小鼠肝臟發育過程中的表達趨勢，結果發現RARα 在胚胎及成年期的小鼠肝臟中持續高表達，RARβ 在胚胎中期表達較高，晚期降低，出生后逐漸增高，而RARγ 在胚胎期表達很低，隨著胎齡增加，逐漸增高，出生后1 個月可達RARα 的表達水平［7］，提示RARγ 參與了肝臟的正常發育和肝細胞成熟分化。Mukhopadhyay B 還報道RARγ 可調控CB(1)R 的表達調節肝臟的脂肪代謝［5］。

本研究希望進一步證實RARγ 對肝細胞體外成熟分化的影響。通過采用Ad-Easy 腺病毒系統［13］，成功構建了3 對特異性針對RARγ 的siRNA腺病毒載體。其中有2 對siRNA 序列對RARγ 有顯著的抑制效果，RARγ 表達的下調使得ATRA 對肝細胞相關基因的誘導作用明顯降低，且糖原合成染色陽性細胞數明顯減少，提示其參與了RA 信號調控的肝細胞成熟分化。然而，不同的研究顯示RARγ 基因在肝腫瘤中有致癌的潛能。RARγ 可激活Akt 和NF-kappaB 信號途徑，促進肝癌細胞的增殖和轉化，增加動物體內成瘤［14］。因此，可提示RARγ 表達的平衡可能控制肝細胞分化成熟度的一個重要因素，過低阻止分化成熟，過高影響細胞轉歸，促進腫瘤發生。

本實驗通過構建Ad-siRARγ 短暫抑制細胞中RARγ 的表達提出RARγ 可能是肝細胞分化中的重要調控因子，為研究RA 信號在肝臟發育、肝細胞分化及肝腫瘤發生發展中的作用提供了新的思路和研究方向。

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