Ezrin介導中性粒細胞彈性蛋白酶誘導的人氣道上皮細胞株分泌黏蛋白增加

李 琪，李 娜，尤列．皮爾曼，維克多．科羅索夫，周向東*

(1．重慶醫科大學第二附屬醫院呼吸內科，重慶400010;2.俄羅斯醫學科學院遠東呼吸生理與病理研究中心，布拉戈維申斯克675000)

慢性阻塞性肺疾病急性加重期及哮喘重度發作尤其是致死性哮喘發作的患者，中性粒細胞在氣道大量募集，氣道黏液常呈“爆發式”分泌狀態，短時期內急劇增多的黏液致廣泛黏液栓形成，出現嚴重氣道阻塞、導致窒息甚至死亡。此現象與細胞的胞吐行為密切相關。胞吐行為主要歸因于細胞的極性活動。Ezrin 作為膜連接蛋白(ezrin/radixin/moesin，ERM)家族的一員，是膜蛋白和肌動蛋白細胞骨架間確切的連接分子，存在于富含肌動蛋白的表面結構，在肺組織里也有明顯表達，其能參與細胞的多種功能活動如細胞黏附、遷移以及細胞表面結構的組裝，與細胞的運動及極性分泌有關［1］。故此推測，Ezrin 是否與氣道上皮細胞的極性分泌有關?是否參與氣道的黏液分泌過程?本研究以中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elatase，NE)作為氣道黏蛋白(mucin，MUC)主要病理性表型MUC5AC 分泌的誘導因素，對Ezrin 在其中的作用作一探討，以期明確氣道炎性反應時黏蛋白胞吐的潛在動力機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人氣道上皮HBE16 細胞株(上海復祥生物科技有限公司);pEGFP-N1-Ezrin-Wt、pEGFP-N1-Ezrin-T567D 和 pEGFP-N1-Ezrin-T567A (法國 Monique Arpin 教授饋贈);pEGFP-N1 空載體(Clontech 公司);DEME/Ham's F12 培養基、HEPES、Trizol 和小牛血清(Sigma 公司);NE(Calbiochem 公司);兔抗Ezrin(H-276)多克隆抗體、HRP-羊抗兔抗體、HRP-兔抗鼠抗體(Santa Cruz 公司);小鼠抗MUC5AC 45M1 單克隆抗體(Neomarkers 公司);OPTI-MEM 無血清培養基培養(Invitrogen 公司);X-treme GENE9DNA 轉染試劑(Roche 公司);MMLV(重組鼠白血病病毒反轉錄酶)第一鏈cDNA 合成試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司);其余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒的雙酶切鑒定:提取純化各組質粒，分別以限制性內切酶Xho Ⅰ及BamH Ⅰ各0.5 μL加入反應體系進行酶切，37 ℃水浴酶切反應2 h。酶切完成后進行電泳分析。

1.2.2 細胞轉染:處于對數生長期的細胞數調整濃度至每孔(1 ～2)×105個/mL，細胞匯合達30% ～50%左右，以OPTI-MEM 無血清培養基培養，加入4 μL X-treme GENE9DNA 轉染試劑混勻，加入重組質粒轉染細胞，按操作說明進行。于37 ℃、5% CO2濕度培養箱孵育，4 ～6 h 換液1 次，24 h 后進行細胞處理并行相關檢測。

1.2.3 細胞的培養及分組處理:于6 孔培養板中培養HBE16 氣道上皮細胞每孔5 ×105個/mL，加入2 mL DMEM/Ham's F12 培養液(含10% 小牛血清)，37 ℃、5% CO2濕度培養箱孵育，常規換液培養，當細胞匯合達70% ～80%時傳代，調整細胞濃度至2 ×105個/mL并分組:1)空白對照組:無血清DMEM/Ham's F12 液中繼續培養;2)NE 刺激組:培養液中加入NE 0.5 μmol/L;3)pEGFP-N1 組:細胞轉染pEGFP-N1 后，無血清DMEM/Ham's F12 液中常規換液培養，不予其他處理;4)pEGFP-N1-Ezrin-Wt組:細胞轉染野生型pEGFP-N1-Ezrin-Wt 后，無血清DMEM/Ham's F12 液中常規換液培養，不予其他處理;5)NE + pEGFP-N1-Ezrin-Wt 組:以pEGFP-N1-Ezrin-Wt 轉染細胞后再加入NE 0.5 μmol/L;6)NE+pEGFP-N1-Ezrin-T567D 組:pEGFP-N1-Ezrin-T567D 中Ezrin 蘇氨酸Thr567 定點突變為天冬氨酸Asp，模擬永久磷酸化Ezrin。以其轉染細胞后再加入NE 0.5 μmol/L;7)NE + pEGFP-N1-Ezrin-T567A 組:pEGFPN1-Ezrin-T567A 中Ezrin 蘇氨酸Thr567 定點突變為丙氨酸Ala，模擬被遏制磷酸化的Ezrin。以其轉染細胞后再加入NE 0.5 μmol/L。由NE 作用的劑量、時間曲線分析選擇濃度為0.5 μmol/L作用30 min(表1)。各組均3 個復孔，繼續培養30 min 后分別收集培養上清和細胞行相關檢測，每組重復實驗3 次。

1.2.4 MTT 檢測各組細胞的活力:96 孔板中每孔按濃度1×104個/mL加入200 μL 細胞懸液，以上處理組各6 個復孔，37 ℃、5% CO2濕度培養箱孵育，分別取10、20、30 和60 min 時間點行MTT 測定。吸除各孔舊培養液，加入200 μL/孔無血清的RPMI-1640 培養液及20 μL/孔MTT 液(5 g/L)，放入37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內培養4 h，吸除各孔原液后加入150 μL/孔二甲基亞砜(DMSO)，微量振蕩器振蕩15 min，自動酶標讀數儀(TECAN sunrise remote 奧地利)以570 nm 波長測定各孔吸光度(A)值。

1.2.5 實時熒光定量PCR 法檢測MUC5AC mRNA水平:Trizol 法分別提取各組細胞內總RNA，經鑒定，樣品A260/A280比值均介于1.8 ～2.0，初步定量后保存于－20℃備用。兩步法行RT-PCR。cDNA 反轉錄反應按PrimeScript 反轉錄試劑盒說明進行。MUC5AC上游引物:5'-CAGCCACGTCCCCTTCAATA-3'，下游引物:5'-ACCGCATTTGGGCATCC-3'。GAPDH 上游引物:5'-GGGAAGGTGAAGGTGGGAGTG-3'，下游引物:5'-AGC AGAGGGGGCAGAGATGAT-3'。反應參數:94 ℃預變性3 min，后緊隨35 個循環，循環參數:94 ℃45 s，58 ℃30 s，70 ℃60 s，后72 ℃延伸5 min采用2－△△CT方法分析目的基因mRNA 相對表達量。CT 是熒光達到熒光閾值的循環數，△△CT=(CT 目的基因－CT 管家基因)實驗組－(CT 目的基因－CT 管家基因)對照組。

1.2.6 ELISA 法檢測細胞及培養上清MUC5AC 蛋白含量:RIPA 裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，測定并調整蛋白濃度備用;收集細胞培養上清液并測定蛋白含量備用。以提取的細胞蛋白或培養上清液于40 ℃包被96 孔酶標反應板，干燥，以PBS 清洗酶標板3 次，2%小牛血清室溫封閉1 h;再次PBS洗滌3 次，加入小鼠抗MUC5AC 單克隆抗體45M1(1∶100，用含0.05%吐溫20 (Tween-20)的PBS 稀釋至50 μL)，孵育1 h;洗滌3 次，加入100 μL 辣根過氧化物酶－羊抗小鼠IgG(1∶10 000)孵育1 h;四甲基聯苯胺過氧化物酶溶液顯色，終止反應后測各孔吸光度A 值(λ =450 nm)，與標準品比較而得到MUC5AC 的相對值。

1.2.7 免疫熒光觀察Ezrin 在HBE16 氣道上皮細胞的表達:貼壁生長良好的HBE16 氣道上皮細胞經消化后，調整細胞濃度為1 ×105個/mL，接種于24孔板中8 mm×8 mm 小玻片進行培養。細胞匯合約70%左右后，換用無血清培養液維持24 h，分組進行不同處理。吸棄培養液，PBS 漂洗。4%多聚甲醛室溫下固定30 min，PBS 漂洗后以0.4%聚乙二醇辛基苯基醚Triton-X 100 作用20 min，PBS 沖洗加5%羊血清封閉30 min。傾去血清后滴加兔抗Ezrin 多克隆抗體(1∶500;1 mg/L)，置濕盒內4 ℃過夜。PBS 漂洗后加FITC 標記的羊抗兔IgG(1∶500)，置濕盒內室溫下孵育30 min，PBS 清洗后滴加5 g/mL PI，孵育5 min 后PBS 漂洗5 min ×3 次。50%的甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察，以QuantReport 軟件分析細胞熒光強度。

1.3 統計學分析

表1 各組MTT 吸光度(A)值Table 1 MTT absorbance value in different cell groups (±s，n=6)

表1 各組MTT 吸光度(A)值Table 1 MTT absorbance value in different cell groups (±s，n=6)

group5 min10 min15 min20 min30 min control0.187 ±0.0030.279 ±0.0080.325 ±0.0100.453 ±0.0070.789 ±0.011 0.01 μmol/L NE0.187 ±0.0040.271 ±0.0030.303 ±0.0080.405 ±0.0030.659 ±0.007 0.1 μmol/L NE0.181 ±0.0030.264 ±0.0070.298 ±0.0050.396 ±0.0120.636 ±0.009 0.5 μmol/L NE0.180 ±0.0050.258 ±0.0040.289 ±0.0060.388 ±0.0080.643 ±0.007 1 μmol/L NE0.179 ±0.0020.253 ±0.0060.271 ±0.00 90.393 ±0.0110.404 ±0.009

2 結果

2.1 重組質粒的雙酶切鑒定結果

分別在4 700 bp、1 801 bp 左右出現目的條帶，與預期的pEGFP-N1 和Ezrin 目的基因片段長度一致(圖1)。

2.2 各組中細胞增殖的變化

各處理因素對細胞的增殖活力無明顯影響(表2)。

圖1 重組質粒的雙酶切鑒定結果Fig 1 Indentification of recombinant constructs by restriction enzyme

2.3 pEGFP-N1-Ezrin 各突變體對MUC5AC 蛋白及MUC5AC mRNA 含量的影響

轉染pEGFP-N1-Ezrin-T567D 的細胞經NE 刺激后，分泌至上清液的MUC5AC 蛋白含量較單純NE 刺激組有明顯上升(P＜0.01)，但細胞內MUC5AC 蛋白含量及MUC5AC mRNA 水平則無明顯變化。而pEGFP-N1-Ezrin-T567A 轉染組在NE刺激后，上清液中MUC5AC 蛋白含量與單純NE組相比有明顯下降(P＜0.05)，胞漿MUC5AC 蛋白含量卻較單純NE 刺激組有所升高(P＜0.05);而MUC5AC mRNA 水平與單純NE 刺激組相比無差別(表3)。

2.4 pEGFP-N1-Ezrin 各突變體對Ezrin 蛋白細胞內表達及分布的影響

轉染pEGFP-N1-Ezrin-T567D 的細胞經NE 刺激后，細胞內Ezrin 表達較野生型pEGFP-N1-Ezrin-Wt轉染組及NE 刺激組明顯增強，且胞膜分布增多(P＜0.05)。pEGFP-N1-Ezrin-T567A 轉染組在NE刺激后，Ezrin 蛋白表達較野生型pEGFP-N1-Ezrin-Wt 轉染組無明顯變化;而與pEGFP-N1-Ezrin-T567D組相比，表達有明顯減少，且未出現向胞膜聚集的趨勢(P＜0.05)(圖2，表4)。

表2 各組MTT 吸光度(A)值Table 2 MTT absorbance value in different cell groups(±s，n=6)

表2 各組MTT 吸光度(A)值Table 2 MTT absorbance value in different cell groups(±s，n=6)

group10 min20 min30 min60 min control0.134 ±0.0040.153 ±0.0130.331 ±0.0150.357 ±0.019 NE0.139 ±0.0090.148 ±0.0110.327 ±0.0120.391 ±0.012 pEGFP-N10.133 ±0.0110.152 ±0.0130.382 ±0.0080.401 ±0.014 pEGFP-N1-Ezrin-Wt0.151 ±0.0080.161 ±0.0110.391 ±0.0130.421 ±0.018 NE+pEGFP-N1-Ezrin-Wt0.132 ±0.0100.181 ±0.0190.422 ±0.0150.405 ±0.021 NE+pEGFP-N1-T567D0.173 ±0.0120.178 ±0.0180.398 ±0.0130.385 ±0.017 NE+pEGFP-N1-T567A0.142 ±0.0080.193 ±0.107 0.394 ±0.0130.407 ±0.018

Table 表33T h各e l組ev細els胞 of中 M黏U蛋C5白AC5AiCn e含ac量h 檢gr測ou結p 果(x比±較s，n=3)

圖2 免疫熒光檢測各組Ezrin 蛋白的表達Fig 2 Expression of Ezrin protein detected by immunofluorescence (×100)

表4 各組細胞中Ezrin 蛋白表達相對熒光強度Table 4 The Ezrin protein expression in each group(±s，n=3)

表4 各組細胞中Ezrin 蛋白表達相對熒光強度Table 4 The Ezrin protein expression in each group(±s，n=3)

#P＜0.01，*P＜0.01 compared with pEGFP-N1 group;*P＜0.05 compared with NE+pEGFP-N1-Ezrin-Wt group．

groupfluorescence intensity pEGFP-N128.97 ±5.36 NE+pEGFP-N140.64 ±7.05 NE+pEGFP-N1-Ezrin-Wt48.85 ±9.32#NE+pEGFP-N1-Ezrin-T567D59.43 ±8.41*NE+pEGFP-N1-Ezrin-T567A41.82 ±4.16

3 討論

氣道黏液的基礎性分泌是呼吸系統的重要屏障，具有異物清除、氣道微環境保護等功能。而病原體、炎性介質、蛋白酶等可誘導細胞胞吐動作的發生，使黏液呈“爆發式”分泌狀態［2－3］。細胞黏液胞吐分泌是一復雜的生物動力學過程，有眾多分子參與。研究發現，膜骨架相關蛋白ERM 家族中的Ezrin 具有連接膜蛋白和細胞骨架的作用，與細胞運動及極性分泌有關［4］。Ezrin 蛋白是多種氨基酸激酶的底物，磷酸化是Ezrin 蛋白活性的重要調節方式［5］。Ezrin 的保守磷酸化位點位于Ezrin Thr 567和Thr564［6］。其中EzrinThr567 還參與胃壁細胞的極性形成［7］、細胞表面膜皺褶及微絨毛的形成［8］。

既往研究證實，NE 是一極強的黏液促動劑，能通過促進黏蛋白表達及胞吐增加使氣道呈現黏液高分泌狀態［9］。本研究結果顯示，經NE 刺激及轉染野生型pEGFP-N1-Ezrin-Wt 后，細胞中Ezrin 蛋白表達明顯增加，在胞膜的聚集亦明顯增多;而模擬Ezrin 永久磷酸化的載體pEGFP-N1-Ezrin-T567D 轉染組，Ezrin 蛋白表達增加更為顯著，主要積聚于胞膜。細胞經轉染模擬被遏制磷酸化Ezrin 的載體pEGFP-N1-Ezrin-T567A 后，Ezrin 在胞膜的表達明顯減少，散在分布于胞質。說明NE 能誘導細胞中Ezrin 向細胞頂膜定位，而在磷酸化載體pEGFP-N1-Ezrin-T567D 轉染組中，該引導作用更為顯著。

pEGFP-N1-Ezrin-T567D 轉染組細胞培養上清中MUC5AC 的蛋白水平較單純NE 組及pEGFP-N1-Ezrin-Wt 組有明顯增加。但胞質中MUC5AC 蛋白水平卻顯示有減少，表明Thr567 永久磷酸化的Ezrin 與野生型Ezrin 相比，更能增加黏蛋白MUC5AC 的胞吐外分泌，使得胞內貯存的MUC5AC相對減少。但就胞內胞外分泌的蛋白總量而言，野生型Ezrin 載體組和磷酸化Ezrin 載體組并無顯著差異。提示Ezrin Thr567 磷酸化對MUC5AC 蛋白的合成并無顯著影響，但在MUC5AC 從胞質向胞外分泌的過程中起著積極推動作用。

此外，pEGFP-N1-Ezrin-T567A 組中，分泌至培養上清的MUC5AC 蛋白較對照組相比，有明顯減少，而胞質中MUC5AC 蛋白含量則高于對照組。表明若EzrinTh567 位點喪失磷酸化功能，NE 尚能刺激MUC5AC 蛋白合成，但其的胞外分泌過程則較EzrinThr567 磷酸化功能正常的野生型載體組明顯減少，導致胞內貯存的MUC5AC 蛋白含量相對增高。

綜上，本實驗表明，Ezrin 是NE 誘導的氣道黏蛋白分泌的重要促動因子，其Thr567 位點磷酸化可能起著關鍵作用。

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