系統性紅斑狼瘡患者外周血miR-7的表達及其意義

李 揚，沈 濂，葉燕霞，張 烜*

(1.首都醫科大學附屬北京天壇醫院血液科，北京100050;1.中國醫學科學院北京協和醫學院北京協和醫院風濕免疫科，北京100730;3.中國醫學科學院北京協和醫學院基礎醫學研究所生物化學與分子生物學系，北京100005)

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種多系統受累的自身免疫性疾病，B細胞的異常增殖活化是SLE 的特征之一［1］。小RNA(microRNAs，miRNAs)是近年來發現的一類單鏈非編碼小RNA，成熟miRNA 能夠在轉錄后水平抑制靶mRNA 表達［2］。近年多項研究證明，miRNAs 參與生物體的生長、發育、衰老、凋亡的調控及遺傳背景的穩定，并與人類疾病相關［3］。miR-7 與多種腫瘤的發生發展密切相關［4－8］，然而miR-7 在自身免疫病特別是SLE 的發病中的作用尚無研究。本研究旨在探索miR-7 在SLE 患者中的表達及功能。

1 材料與方法

1.1 標本來源

北京協和醫院2009 至2010年門診初治SLE 患者20 例，均符合美國風濕病學會1997年修訂的SLE 診斷標準，排除患有其他全身性疾病者。正常對照20 例來自健康志愿者，年齡、性別與病例匹配，同時不得具備SLE 診斷標準中的任何一條。經北京協和醫院倫理委員會批準，納入研究前患者簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

淋巴細胞分離液(國藥集團化學試劑有限公司);流式熒光抗體PE-CD3，FITC-CD19，APCCD14;Trizol 和Cell TraceTMCFSE 增值檢測試劑(Invitrogen 公司);RNA 提取試劑盒和反轉錄試劑盒(天寶生物工程有限公司);miR-7 表達檢測試劑盒(ABI 公司);miR-7 前體Pre-miRTM-miR-7 前體及陰性對照Pre-miRTMmiRNA 前體-陰性對照，miR-7 抑制劑anti-miRTM-miR-7 抑制劑及陰性對照anti-miRTMmiRNA 抑制劑-陰性對照(Ambion 公司);B 細胞電轉試劑盒(Amaxa 公司)。

1.3 外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的分離及T、B 細胞及單核細胞的分選

將PBS 稀釋后的外周血細胞懸液貼壁緩慢的加入預置淋巴細胞分離液的離心管中，2 000 r/min室溫離心20 min，吸取白膜層細胞即PBMC，PBS 洗滌2 次，加入熒光抗體PE-CD3、FITC-CD19 和APCCD14，4 ℃避光孵育20 min，0.5%牛血清白蛋白的PBS 洗滌2 遍，通過流式細胞儀分選T、B 細胞及單核細胞。

1.4 熒光定量PCR

提取20 例SLE 患者及20 例HC 的PBMC、T 細胞、B 細胞和單核細胞中的總RNA(包括microRNA)，1.2%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度儀，檢測總RNA 的質量和濃度。采用TaqMan 試劑盒檢測miR-7 的表達，采用2－△△Ct法計算樣品目的基因的相對表達量。PCR 反應體系為20 μL，其中包含TaqMan MicroRNA Assay(×20)探針1 μL，2 ×Taq-Man 通用PCR 預混液(Universal PCR Master Mix)10 μL，去核酸酶水7．67 μL，反轉錄產物1.33 μL。反應條件為95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，40個循環。每個樣本3 個復孔。引物設計如下:PTEN上游引物:5'-CCAGGACCAGAGGAAACC-3'，下游引物:5'-GCTAGCCTTCTGGATTTGA-3'。

1.5 雙熒光素酶報告基因系統驗證預測的miR-7的靶基因

將miR-7 前體或對照與含有預測靶基因PTEN 3'UTR 區的報告質粒共轉染入293T 細胞中，以預測的非靶基因IL-10 作為該系統的陰性對照，設計與miR-7 前體序列完全互補的序列作為該系統的陽性對照，測定細胞熒光素酶活性。所有實驗均重復2次，每次3 個復孔。

1.6 細胞增殖的檢測

分選B 細胞后分4 組，分別轉染miR-7 前體及前體陰性對照、miR-7 抑制劑及抑制劑陰性對照，染色羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl Ester，CFSE)后，4組細胞均培養于RPMI 1640 完全培養基中，給予CD40L (20 μg/L)、anti-IgM (10 mg/L)、CpG(2.5 mg/L)刺激培養，5 d 后收取細胞上流式機檢測CFSE。

1.7 統計學分析

數據均采用SPSS 13.0 統計軟件分析。經過Kolmogorov-Smirnov 和Shapira-Wilk 檢驗為正態性分布、方差一致的數據用均數± 標準差(±s)表示，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗。

2 結果

2.1 SLE 患者miR-7 的表達上調

初治SLE 患者和HC 各8 例，SLE 患者PBMC中miR-7 的表達為0.86 ±0.03，顯著高于HC 的0.10 ±0.08，(P＜0.01)，流式細胞儀分選SLE 患者及HC 各12 例的T、B 細胞及單核細胞，SLE 患者B細胞中miR-7 的表達為0.59 ±0.08，顯著高于HC的0.31 ±0.06(P＜0.05)，然而SLE 患者T 細胞及單核細胞中miR-7 的表達與HC 無差異，分別為0.91 ± 0.18 和0.99 ± 0.18，及1.30 ± 0.36 和0.98 ±0.02.

2.2 PTEN 是miR-7 的靶基因

通過Targetscan、PicTar 及miRanda3 個軟件均預測到PTEN 的3'UTR 區存在miR-7 的結合位點(圖1A)，采用雙熒光素酶報告基因系統進行驗證，結果顯示，過表達的miR-7 能夠通過與互補序列結合有效抑制熒光素酶活性，說明miR-7 可以通過與PTEN 的3'UTR 區相互作用發揮功能(圖1B)。在SLE 患者B 細胞中，過表達或抑制表達miR-7 后，PTEN 的mRNA 相對表達量相應為0.82 ±0.18 及1.84 ±0.54(P＜0.05)，，說明過表達miR-7 能夠在一定程度抑制PTEN 的基因表達，而抑制miR-7 能夠促進PTEN 的基因表達(圖1C).因此gPTENg 是miR-7 的直接靶基因。

圖1 PTEN 是miR-7 的直接功能靶基因Fig 1 PTEN is a direct target of miR-7

2.3 SLE 患者B 細胞中PTEN mRNA 水平較HC下調

20 例初治SLE 患者B 細胞中PTEN mRNA 為0.92 ± 0.24，顯著低于20 例 HC 的 2.20 ±0.49 (P＜0.05)。

2.4 miR-7 能夠促進B 細胞的增殖

在SLE 患者B 細胞中過表達miR-7 后，B 細胞增殖能力為35.12% ±8.16%高于miR-7 被抑制的B 細胞23.55% ±6.92%(P＜0.05)，說明miR-7 能夠促進B 細胞的增殖(圖2)。

3 討論

SLE 發病機制復雜，B 細胞異常增殖活化在其發病機制中占有重要地位，B 細胞通過分泌自身抗體，攝取和提呈自身抗原參與自身免疫現象的啟動和維持。已有研究發現miRNA 參與多種自身免疫病的發生［9］。

本研究證實SLE 患者B 細胞中miR-7 的表達顯著高于HC，通過microRNA 靶基因預測軟件預測miR-7 可能的靶基因，挑選了與SLE 密切相關的基因PTEN 進行進一步研究。

PTEN 是迄今為止發現的第一個具磷酸酶活性的抑癌基因，負調節PI3K/AKT 信號通路。在骨髓發育的未成熟B 細胞，PTEN 失活會使PI3K/AKT持續性激活，影響自身反應性B 細胞的清除和中樞免疫耐受的形成［10］。PTEN 缺失易發生自身反應性淋巴細胞增多、B 細胞類別轉換缺陷、活化誘導的胞苷脫氨酶缺陷，導致外周血B 細胞數量的上升及抗凋亡能力上升［11］。本研究發現SLE 患者外周血B 細胞中miR-7 的表達較健康對照上調，PTEN mRNA的表達較健康對照減少，為了明確SLE 患者PTEN 的下調是否與miR-7 的上調有關，采取多種方法進行驗證。生物信息學預測方法及雙熒光素酶報告基因系統驗證方法均支持PTEN 是miR-7 的靶基因，并且，通過體外轉染人的外周血B 細胞，使其過表達或者抑制表達miR-7 后，PTEN 的mRNA水平相應下調或上調，進一步證明miR-7 可直接負調控PTEN。在SLE 患者外周血B 細胞中過表達或者抑制表達miR-7，B 細胞增殖功能相應增強或減弱，證明miR-7 能夠促進B 細胞增殖。因此，SLE 患者B 細胞中上調的miR-7 可能通過下調PTEN 基因的表達而促進B 細胞增殖，從而參與SLE 的發病。

圖2 miR-7 對B 細胞增殖的調控Fig 2 Modulation of B cells proliferation by miR-7

綜上所述，SLE 患者B 細胞中miR-7 上調可能是發病環節之一，miR-7 通過抑制PTEN 的表達而促進B 細胞增殖。提示miR-7 可能是治療SLE 的潛在靶點之一。在今后的工作中，可以深入研究miR-7 是否通過PTEN/PI3K/Akt 通路參與SLE 患者B 細胞的增殖、分化及細胞因子分泌等，明確該機制異常在SLE 發病中的作用。

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