五沒食子酰基葡萄糖對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖與凋亡的影響

沈丹蓓 蔣明軍

五沒食子酰基葡萄糖對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖與凋亡的影響

沈丹蓓 蔣明軍

目的: 確定五沒食子酰基葡萄糖對瘢痕疙瘩細胞增殖與凋亡的影響。方法: 用細胞生長實驗，細胞周期分析，細胞姬姆薩染色比較五沒食子酰基葡萄糖、五倍子單寧酸和秋水仙堿對瘢痕組織成纖維細胞，Hacat細胞和腫瘤細胞在增殖與凋亡方面的影響。結果: 五沒食子酰基葡萄糖對瘢痕疙瘩成纖維細胞和黑素瘤A375細胞的增殖有較強的抑制作用，對成纖維細胞的作用呈時間和劑量依賴性，對HaCat細胞的增殖呈雙相作用，低濃度為促進作用，高濃度為抑制作用，可使增殖受抑制細胞的細胞周期發(fā)生改變，表現(xiàn)為S期阻滯。凋亡細胞顯著增加。結論: 五沒食子酰基葡萄糖對瘢痕疙瘩成纖維細胞有抑制增殖和促進凋亡的作用，對治療瘢痕疙瘩可能是一個具有開發(fā)潛力的活性物質。

五沒食子酰基葡萄糖； 增殖； 凋亡

單寧酸是中藥五倍子中的主要活性成分，五倍子單寧酸是一種混合物，包含有數(shù)種基本結構相近的化合物，這些化合物在分子量、結構和含量方面不同，使它們的生物活性產生差異。五沒食子酰基葡萄糖或原型沒食子鞣質(PGG，Beta－1，2，3，4，6－penta－O－galloyl－D－glucopyranose)分子結構中有5個相同的由核心葡萄糖上的羥基與沒食子酸上的羧基縮合成的酯鍵，結構穩(wěn)定不易水解，分子量為940，是單寧酸中的主要活性物質，具有抗氧化、抗增殖等作用。1－3在我們以往的研究中發(fā)現(xiàn)，五倍子中的單寧酸可以以時間和劑量相依賴的方式抑制異常瘢痕成纖維細胞的體外增殖。本次研究中我們主要觀察了PGG和單寧酸對瘢痕疙瘩不同來源細胞在增殖與凋亡方面的影響。探索PGG成為治療瘢痕疙瘩藥物的可能性。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑 五倍子單寧酸由中國科學院江蘇省藥用植物研究中心袁昌齊研究員提供，PGG由美國邁阿密大學Hagerman教授贈送，秋水仙堿購于昆明制藥廠，甲基噻唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)均為Sigma產品，DMEM培養(yǎng)基(HyClone)，胎牛血清(杭州四季青生物制品廠)。

1.2 細胞培養(yǎng) 人黑素瘤A375細胞、人肝癌BEL7402細胞和人皮膚HaCat細胞來源于中科院上海細胞所。細胞接種在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中(100 U/m L青霉素，100μg/m L鏈霉素)，在37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。瘢痕疙瘩成纖維細胞、增殖性瘢痕成纖維細胞、結締組織痣成纖維細胞和正常人皮膚成纖維細胞從我所門診外科手術切除的標本中分離培養(yǎng)，在無菌條件下按常規(guī)組織培養(yǎng)技術培養(yǎng)成纖維細胞，4第3代或第4代細胞用于實驗。

1.3 細胞生長實驗 用含0.02%EDTA的0.25%的胰酶消化80%融合的單層培養(yǎng)細胞。調整細胞濃度為5×104個細胞/ml，并接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種100μL。向96孔板中分別加入設定濃度的五倍子單寧酸、PGG和秋水仙堿。每個濃度3個孔，以不加藥物的培養(yǎng)物為實驗的對照組，同時每種藥物的每個濃度均設無細胞對照孔。在37℃，含5%CO2的孵箱中培養(yǎng)72 h后，每孔加入MTT(Sigma)溶液(5 mg/ mL)10μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去孔內培養(yǎng)液。每孔加入100μL的DMSO，振蕩10 min，使結晶充分溶解。在490 nm波長的酶聯(lián)免疫檢測儀(南京華東電子管廠)上以各自的對照孔調零，測定各孔光吸收值，計算細胞體外生長的細胞存活率(實驗組OD/對照組OD)。

1.4 細胞周期分析 用含0.02%EDTA 0.25%胰酶消化80%融合單層培養(yǎng)細胞。接種于25 mL培養(yǎng)瓶，細胞密度為1×105個細胞/cm2。同時加入設定濃度的藥物樣品，培養(yǎng)48 h后收集1×106個以上細胞，冷PBS洗滌后，75%乙醇固定，PBS洗后加入1 mL PI溶液用流式細胞儀(BD FACSCalibur)測定。

1.5 凋亡細胞的姬姆薩染色 在含藥物樣品的培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h的細胞和不加藥對照組細胞，用PBS洗后調整細胞濃度為106個細胞/mL，取100μL細胞懸液均勻涂布于載玻片上，干后用甲醇固定10 min，晾干。在細胞上滴加姬姆薩染色工作液，室溫染色10 min。洗去染液，室溫晾干24 h，樹脂封片。在普通光學顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)。

1.6 細胞計數(shù)法測定細胞生長 用血細胞計數(shù)板計數(shù)各實驗組的細胞總數(shù)。

2 結果

2.1 PGG對成纖維細胞的生長抑制作用 我們分別測定了PGG和單寧酸對瘢痕疙瘩成纖維細胞、增殖性瘢痕成纖維細胞、結締組織痣成纖維細胞和正常人皮膚成纖維細胞的體外增殖的影響。發(fā)現(xiàn)PGG和單寧酸對瘢痕疙瘩成纖維細胞有較強的抑制作用，并呈時間和劑量依賴性，對正常成纖維細胞的抑制作用最小(圖1a，1b，1c)。

圖1 a:PGG對不同組織來源成纖維細胞增殖抑制；b:單寧酸對不同組織來源成纖維細胞增殖抑制；c:10μg/mL PGG對瘢痕疙瘩成纖維細胞生長的影響

2.2 PGG對HaCat細胞增殖的影響 PGG和單寧酸對HaCat細胞的增殖呈雙相作用，PGG在低于5μg/ mL時對細胞的生長為促進作用，高于5μg/m L時對細胞的生長為抑制作用。單寧酸對HaCat細胞生長的促進作用強于PGG，在低于20μg/m L時對細胞的生長為促進作用，高于20μg/m L時對細胞的生長為抑制作用，而秋水仙堿在實驗的各個濃度對HaCat細胞的生長均為抑制作用(圖2)。

2.3 PGG對腫瘤細胞的作用 PGG對黑素瘤A375細胞的增殖有較強的抑制作用，20μg/mL作用48 h即達細胞生長的半數(shù)有效抑制濃度。而在相同濃度下對肝癌BEL7402細胞無抑制作用。單寧酸和秋水仙堿在這一濃度下對A375細胞的作用明顯低于PGG(圖3)。

圖2 不同藥物對HaCat細胞體外增殖的影響

2.4 PGG可使細胞周期發(fā)生改變 PGG可使瘢痕疙瘩成纖維細胞和A375細胞的細胞周期發(fā)生顯著改變，減少G0～G1細胞，顯著增加S期細胞，使G2～M期細胞降為零。但對人肝癌BEL7402細胞幾乎無作用。單寧酸也可使細胞周期發(fā)生改變，但作用不及PGG。秋水仙堿可減少G0～G1期細胞，顯著增加S期細胞(表1)。

圖3 不同藥物對A375細胞體外增殖的影響

2.5 PGG可促進細胞凋亡 PGG和秋水仙堿可顯著增加凋亡細胞的量，鏡下可見經姬姆薩染色的細胞中，經PGG作用的細胞，有大量胞核濃染、染色質濃縮、核仁消失的細胞。經秋水仙堿作用的細胞，細胞的胞核較大，核仁消失(表1，圖4a，4b，4c)。

表1 10μg/mL藥物樣品對細胞周期的作用

圖4 a:未加藥瘢痕疙瘩成纖維細胞(×200)；b:10μg/mL PGG 48 h后的瘢痕疙瘩成纖維細胞(×200)；c:10μg/mL秋水仙堿48 h后的瘢痕疙瘩成纖維細胞(×200)

3 討論

目前，國際上對可水解單寧類中的多酚類化合物(包括單寧酸)的藥理活性研究主要有:促進細胞凋亡作用，抗氧化作用，抗細胞突變和免疫調節(jié)作用。其中與目前瘢痕疙瘩防治策略相關的藥理學活性主要是促進細胞凋亡和免疫調節(jié)的作用。單寧酸可以時間和劑量相依賴的方式抑制腫瘤細胞在體內和體外的生長和增殖，這一作用主要是因為單寧酸的促細胞凋亡活性。在我們以往的研究中發(fā)現(xiàn)，五倍子中的單寧酸可以時間和劑量相依賴的方式抑制異常瘢痕成纖維細胞的體外增殖，抑制細胞分泌膠原蛋白。在同一實驗濃度下對異常瘢痕成纖維細胞的抑制作用強于正常對照細胞。在50μg/mL及其以下濃度時對正常人角質形成細胞的增殖有促進作用，但對正常人皮膚黑素細胞的增殖有抑制作用。5，6五倍子單寧酸是一種混合物，包含有數(shù)種基本結構相近的化合物，這些化合物在分子量、結構和含量方面不同，使它們的生物活性產生差異。其中，五－間雙棓酰－葡萄糖[penta－(m－digalloyl)－glucose]是五倍子單寧酸的代表性結構。其分子結構中含有縮酚酸類酯鍵(depside bond)，結構相對不太穩(wěn)定，可水解為PGG和沒食子酸甲酯及沒食子酸。PGG分子結構中有5個相同的由核心葡萄糖上的羥基與沒食子酸上的羧基縮合成的酯鍵(aliphatic ester bond)，不含有縮酚酸類酯鍵，結構較穩(wěn)定，相對不易水解，分子量為940，是單寧酸中的主要活性物質。

秋水仙堿在臨床上可用于瘢痕疙瘩的輔助治療。它通過解聚微管，抑制成纖維細胞增殖，提高膠原酶活性來干擾膠原合成。Blazek等建立的瘢痕疙瘩無胸腺小鼠模型證實了秋水仙堿的治療作用。7，8在我們以往的研究中發(fā)現(xiàn)秋水仙堿對人皮膚成纖維細胞、角質形成細胞、黑素細胞的增殖均有較強的抑制作用。5，6

成纖維細胞、HaCat細胞、黑素瘤A375細胞和人肝癌BEL－7402細胞分別來源于中胚層、外胚層、外胚層神經嵴和內胚層，有不同的生物學行為。這些不同來源的細胞在增殖和凋亡方面對藥物反應的異同可比較藥物作用的特異性，同時推測其毒副作用。本研究中發(fā)現(xiàn)PGG對瘢痕疙瘩成纖維細胞和黑素瘤A375細胞的增殖有較強的抑制作用，并且對成纖維細胞的作用呈時間和劑量依賴性；對HaCat細胞的增殖呈雙相作用，低濃度為促進作用，高濃度為抑制作用；可使增殖受抑制細胞的細胞周期發(fā)生改變，表現(xiàn)為S期阻滯；凋亡細胞顯著增加，細胞呈現(xiàn)胞核濃染、染色質濃縮、核仁消失。說明PGG不是一個廣譜的細胞毒性物質，它對細胞的作用具有選擇性。特別是它對瘢痕疙瘩成纖維細胞的抑制增殖促進凋亡的作用。而秋水仙堿對成纖維細胞、HaCat細胞、黑素瘤A375細胞的增殖均有較強的抑制作用。目前臨床上缺少一個明確的瘢痕疙瘩的優(yōu)化治療方案，缺乏安全有效的治療藥物。我們認為PGG在治療瘢痕疙瘩方面是一個具有開發(fā)潛力的活性物質。

1 Zhang J，Li L，Kim SH，et al.Anti－cancer，anti－diabetic and other pharmacologic and biological activities of penta－galloyl glucose.Pharm Res，2009，26(9):2066－2080.

2 Yi W，F(xiàn)ischer J，Krewer G，et al.Phenolic compounds from blueberries can inhibit colon cancer cell proliferation and induce apoptosis.JAgric Food Chem，2005，53(18):7320－7329.

3Huang HC，Lin CL，Lin JK.1，2，3，4，6－penta－O－galloyl－β－D－glucose，quercetin，curcumin and lycopene induce cell－cycle arrest in MDA－MB－231 and BT474 cells through downregulation of Skp2 protein.JAgric Food Chem，2011，59(12):6765－6775.

4方富德.現(xiàn)代醫(yī)學實驗技巧全書(上).1版.北京:北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社，1998.77－78.

5沈丹蓓，夏隆慶，鞠強，等.五倍子等對體外培養(yǎng)的人皮膚瘢痕組織成纖維細胞生長的影響.中華皮膚科雜志，2002，35 (4):299－301.

6沈丹蓓，夏隆慶.五倍子對角質形成細胞、黑素細胞、成纖維細胞體外增殖的影響.中華皮膚科雜志，2005，38(2):95－97.

7Blazek J，Ottomann C，Muehlberger T.Pharmacological therapy of keloids in an athymicmousemodel.Handchir Mikrochir Plast Chir，2008，40(2):81－87.

8 LawrenceWT.In search of the optimal treatment of keloids:report of a series and a review of the literature.Ann Plast Surg，1991，27(2):164－178.

(收稿:2013－04－10 修回:2013－07－28)

The effect of pentagalloyl glucose on the proliferation and apoptosis of fibroblasts originated from keloid tissue

SHEN Dan-bei，JIANG Ming-jun.Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences，Nanjing，210042

Objective:To determine the effect of pentagalloyl glucose on the proliferation and apoptosis of keloid fibroblasts.Methods:The impact of pentagalloyl glucose，gallotannin and colchicine on the proliferation and apoptosis of keloid fibroblasts，HaCat cells and melanoma A375 cells was determined by cell growth test，cell cycle analysis and Giemsa stainmethod.Results:Pentagalloyl glucose had a relatively strong inhibitory effecton keloid fibroblasts andmelanoma A375's proliferation.It significantly inhibited fibroblast proliferation in a dose－and time－dependentmanner.Ithad dual roles on the proliferation of HaCat.Itenhanced the proliferation in low concentration and an inhibitory effect in high concentration.It inhibited the growth of dermal fibroblasts by interfering with cell cycle progression from S phase to G2/M phase.Cell Giemsa stain showed that there were increase in cells apoptosis.Conclusion:Pentagalloyl glucose can inhibit proliferation and enhance apoptosis of keloid fibroblasts.It can be a potential active substance in the treatment of keloid.

pentagalloyl glucose；proliferation；apoptosis

江蘇省自然科學基金(編號:BK2011130)

中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所，南京，210042