加標回收試驗在檢測克倫特羅殘留中的應用

丁 丹方友平楊勇敏王有祥黎俊君

1.湖北省十堰市動物產品質量監督檢驗測試中心，湖北十堰 442000；2.湖北省十堰市動物衛生監督所，湖北十堰 442000

加標回收試驗在檢測克倫特羅殘留中的應用

丁 丹1方友平2楊勇敏2王有祥2黎俊君1

1.湖北省十堰市動物產品質量監督檢驗測試中心，湖北十堰 442000；2.湖北省十堰市動物衛生監督所，湖北十堰 442000

為判定用酶聯免疫吸附法測定克倫特羅及其殘留的結果準確性，筆者對豬尿、豬肝及豬血清中克倫特羅進行了檢測及回收試驗分析。結果發現：用酶聯免疫吸附法測定克倫特羅及其殘留的實驗室過程處于可控范圍內，檢測結果準確、可靠；但豬肝樣品的處理會對檢測結果產生一定影響，應加以避免。

加標回收試驗；檢測；克倫特羅；殘留；應用

加標回收試驗是實驗室常用的質量監督和內部質量控制方法之一，可查找系統誤差的某些來源，其對質量控制和檢測數據的準確性、可靠性有著十分重要的實踐意義。特別是在克倫特羅及其殘留檢測過程中，由于待檢物資的含量處于痕量或微量水平，加之樣品中不同組分對待檢物質的交叉影響等，因此，實施嚴格質量控制對保證檢測數據準確可靠相當重要。

克倫特羅屬于β類興奮劑，我國規定禁止在動物生產中添加使用，但受經濟利益的驅使，非法添加屢禁不止，中毒事件時有發生。當前全國市、縣級以下實驗室主要采用酶聯免疫吸附法來檢測豬尿、組織中克倫特羅的殘留。筆者通過試驗對豬尿、豬肝及豬血清中克倫特羅檢測的回收試驗分析，判定實驗室過程是否處于可控范圍，對判定檢測結果準確性有一定的實際意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）試驗儀器。Sunrise酶標儀 (濾光片波長為450 nm/630 nm），離心機（3 000～4 000 r/min），微量移液器（10～300 μL，單道、多道），氮吹儀。

2）試驗材料。試驗用6頭育肥豬所采食飼料中添加5 mg/kg鹽酸克倫特羅，連續飼喂20 d后停止，休藥期滿20 d時，同時采集豬血清、豬尿及豬肝樣品，對應編號。

3）試驗試劑。酶聯免疫檢測試劑盒（購自北京維德維康生物技術有限公司）、乙酸乙酯（分析純）、異丙醇（分析純）等。

1.2 方 法

1）試樣的制備。豬尿、豬血清：3 000 r/min離心10 min，取上清液作為供試樣品。豬肝：準確稱取（2.00±0.01）g樣品，加入6 mL 0.2 mol/L高氯酸溶液；室溫（25℃）下，劇烈渦動2 min，4 000 r/min離心10 min，將上清液轉入新的離心管中，用1 mol/L NaOH溶液調pH值至11.6左右；加入8 mL乙酸乙酯-異丙醇（8∶2）溶液，室溫下劇烈渦動2 min，4 000 r/min離心10 min，取4 mL上層有機相于新的離心管中，于60℃水浴中，氮氣吹干；加入500 μL樣品稀釋液，充分渦動1 min，取上清液作為供試試料。

2）加標回收方法。回收試驗分為空白加標回收和樣品加標回收。回收率是判定分析結果準確度的量化指標，相對標準偏差是衡量結果精密度的量化指標。本試驗主要研究ELISA方法測定鹽酸克倫特羅時，平行樣測定結果的相對標準偏差、空白加標

回收率、實際樣品加標回收率、空白加標回收率相對標準偏差及樣品加標回收率相對標準偏差5個質控指標的定量評價標準。

3）加標量。加標量為檢出限的2～6倍。根據農業部鹽酸克倫特羅的最低檢測標準1 μL/L標準，豬尿、豬血清試料空白加標和實際樣品加標的加標量為分別2、4和6 μL/L3個濃度，每個加標量濃度作6個平行，同時做6個平行的樣品檢測；豬肝試樣分別在樣品處理前和處理完成后進行加標試驗。檢測過程始終在相同的試驗條件下進行，減少人員、儀器、環境等條件變化對結果產生的影響。

4）檢測步驟。按ELISA試劑盒說明書操作。超出標準曲線的樣品按一定的比例用蒸餾水稀釋后進行檢測。

5）回收率、相對標準偏差的計算。

相對標準偏差（RSD）是樣本標準偏差和回收率平均值間的百分比值，相對標準偏差值越小，檢測結果精密度越高。其計算公式為：

2 結果與分析

豬尿、豬血清加標回收率見表1，樣品中克倫特羅含量見表2，豬肝加標回收試驗結果見表3，空白加標回收試驗結果見表4。

表2 豬尿、豬血清的檢測結果

表3 豬肝加標回收試驗結果

表4 空白加標回收試驗結果

1）由表1和表2可知，不同樣品中添加不同濃度標準品，加標回收率為60.2%～100.5%，在試劑盒規定的回收率范圍（60%～120%）內；精密度均在相同的范圍內，表明檢測結果在實驗室內得到了有效控制。

2）由表3可知，樣品處理前加標回收率為60.2%～79.6%，樣品處理后加標回收率為85.6%～95.6%，樣

品處理后加標回收率明顯高于樣品處理前的加標回收率。表明樣品處理過程對試驗結果準確性產生很大的影響，試驗時應考慮樣品處理過程中對試驗結果產生影響的因素。

表1 豬尿、豬血清加標回收試驗結果

3）由表2和表4可知，試樣及空白加標重復測定結果相對標準偏差均小于0.5%，說明檢測操作過程對測定結果的影響相對較小，在試驗誤差允許范圍內。

3 討論

1）加標回收率反映了檢測結果的準確度，相對標準偏差反映了檢測結果的精密度，可有效的運用到克倫特羅藥物殘留的檢測中，對試驗分析的準確度有著較好的監控作用，能夠及時發現試驗過程中存在的問題是由于系統誤差產生還是偶然誤差產生的，并提出改進的方法，有效提高檢測人員的技術水平。

2）由試驗結果可知，向含有克倫特羅的豬尿、豬血清添加不同濃度標準品，回收率和空白添加回收率基本相同，因此，設計回收試驗時，可直接用空白加標回收作為質量控制的手段之一。豬肝樣品需進行復雜的樣品前處理程序，設計回收試驗時，最好在樣品處理前添加克倫特羅，以便能及時發現影響結果準確性的因素，采取有效措施加以改正。

3）在檢測過程中應控制好試驗條件，避免影響試驗結果的各種因素（如人員、儀器、環境、檢測方法等）發生變化。應合理設計回收試驗，評價試驗結果的可信度，對發現結果存在較大偏移的，應立即采取有效措施，取得滿意的結果。

4）加標回收試驗是實驗室質控手段的一種，具有簡單、易操作等特點，特別適合于樣本數量大的檢測，但在實際檢測工作中需要結合其他質控方法，對實驗室檢測結果實施全面質量控制。

蛋雞養殖如何巧省料

1）保證充足的飲水。雞每產一枚雞蛋需要消耗340 mL水，若在產蛋時缺水，可使產蛋量下降30%。

2）淘汰低產母雞。雞群中常有10%～30%的低產雞，把低產雞淘汰掉，雞群的產蛋量不會明顯減少，但可以大大節省飼料。

3）把好飼料關。不喂發霉變質的飼料，保證飼料的全價營養飼料；粉碎不能過細，否則易造成采食困難且“料塵”飛揚而浪費。

4）使用替代料。蛋白質飼料尤其是魚粉的價格較高，用一些廉價的昆蟲、蚯蚓、當地的小魚蝦、肉類加工的副產品、魚的下腳料、粉渣、糖渣、豆腐渣、酒糟等，經適當加工調制后替代部分蛋白質飼料喂雞，可大大降低飼料成本。

5）添喂桿菌肽鋅。夏季在雞日糧中添加100～150 mg/kg桿菌肽鋅，可使產蛋量提高20%，飼料轉化率提高10%，蛋殼厚度也明顯增加。

6）添喂蛋氨酸。在一般飼料中添加0.1%的蛋氨酸，可使飼料蛋白質的利用率提高2%～3%。

7）添喂維生素C。在每噸雞飼料中添加50 g維生素C，可使產蛋率提高10%以上，節省飼料15%以上。

8）添喂沙礫。每周適量補喂1次沙礫，有助于肌胃中飼料的研磨，幫助消化和吸收，使飼料消化率提高3%～8%。

9）添喂麥飯石。在蛋雞日糧中加入2%的麥飯石粉，可提高產蛋率8.43%，降低死亡率1.11%，每產1 kg蛋節料46 g。

10）添喂蒼耳餅。蒼耳餅是蒼耳果實榨油脂后的副產品，含粗蛋白質39%及微量鎮靜物質，在蛋雞基礎日糧中加入10%的蒼耳餅粉，可使產蛋率提高8.35%，蛋重提高2.8%，飼料報酬提高4.7%。

11）改進料槽結構。喂雞的料槽應該是底尖、肚大、口小，因為這樣的料槽容料多，雞也不容易把飼料啄出來，使雞能吃凈剩料。至于料槽高度，應以雞能自由采食為主要準則。料槽添料量不宜過滿，一般掌握在1/3槽高，否則易拋撒、浪費。據報道，飼料添加到料槽的2/3時飼料浪費12%，加到1/2時浪費5%，加到1/3時浪費2%。

來源：中國禽病網

2014-03-04

楊勇敏

丁 丹，女，1977年生，碩士，獸醫師。