類葉升麻苷通過誘導血紅素加氧酶-1的表達抑制MPP+誘導的PC12細胞損傷

王洪權，王玉敏，崔其福，趙偉麗，成 龍

(赤峰學院醫學院附屬醫院1.神經內科;2.腫瘤內科，內蒙古赤峰024005;3.中國醫學科學院藥用植物研究所藥理毒理研究中心，北京100097)

氧化應激(oxidative stress，OS)損傷在帕金森病(Parkinson's disease，PD)的發病機制及其多巴胺能神經元死亡中發揮重要作用［1］。針對抗OS 的策略則成為PD 有效的治療途徑。

研究顯示上調HO-1 的表達具有廣泛的細胞保護作用。HO-1 在帕金森病中的作用引起了廣大研究者的注意［2-3］。一些化合物通過誘導HO-1的表達可在帕金森疾病模型中發揮神經保護作用［4］。因此鑒定出具有誘導HO-1 表達的化合物成為目前國際的研究熱點。類葉升麻苷(acteoside，AS)是一種糖苷類，具有神經保護活性，其可以抑制1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridinium ion，MPP+)誘導的細胞損傷［5-6］，但其神經保護機制有待于進一步研究。本研究探討AS 是否能夠在PC12 細胞中上調HO-1 的表達，明確后者上調是否參與其對MPP+誘導損傷的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 試劑

類葉升麻苷(winherb medical technology Inc)，HO-1 抗體(#SPA895，Stressgen)，HO-1 抑制劑鋅原卟啉ZnPP(SC-200329)和免疫印跡化學發光試劑(Santa cruz)，PVDF 膜(Millpore 公司)。MTT 和MPP+(Sigma 公司)。

1.2 細胞存活率的檢測

MTT 法檢測細胞活力，參照文獻［7］。PC12 細胞(ATCC)接種在含5% 胎牛血清，10% 馬血清，100U/ml 青霉素，100μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養基中(pH7.2)，37℃，5% CO2 溫育。

1.3 RT-PCR 檢測HO-1 mRNA 表達

Trizol 提取總RNA。HO-1 和β-actin PCR 反應條件為:94 ℃2 min，94 ℃30 s，54 ℃30 s，和72 ℃45 s 共25 循環。根據文獻設計合成引物，擴增出的片段大小為HO-1(322 bp)，β-actin(494 bp)。擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳，EB 染色，紫外下拍照記錄。

1.4 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測HO-1表達

依據參照文獻［8］中方法。使用RIAP 緩沖液裂解細胞，用BCA 試劑測定蛋白含量，通過電泳緩沖液調整各組含量為5 μg /L，每個樣本上樣量為50 μg，在10%聚丙烯酞胺凝膠(SDS-PAGE)進行電泳后轉移至PVDF 膜，預染蛋白標準分子質量確定蛋白分子質量標準位置。用含10%脫脂奶粉吐溫鹽緩沖液(TBS)液封閉，TBS 洗15 min×3;加入1 抗，4 ℃振蕩孵育過夜，TBST 洗10 min×3;1∶10 000 加入辣根過氧化物酶標記相應的二抗，37 ℃振蕩孵育1 h，TBS洗10 min×3;按ECL 試劑盒進行熒光顯色反應。暗室中曝光，顯影，定影。用分析軟件Bio-Rad 分析每個條帶的吸光度值，以目的蛋白豐度/β-actin 蛋白吸光度比值的均數±標準差來表示。以β 肌動蛋白作為內參照，計算待測蛋白條帶積分吸光度與β 肌動蛋白的比值，表示待測蛋白的相對表達水平。

1.5 免疫熒光檢測HO-1 在細胞內定位

參照文獻中的方法［9］。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 類葉升麻苷抑制MPP+誘導的細胞存活率的下降

1 mmol/L MPP+作用PC12 細胞24 h 后，細胞存活率較對照組顯著下降(P＜0.05)。AS(20 和30 μmol/L)預處理2 h 后，可明顯抑制MPP+所導致的細胞存活率的下降(P＜0.05)(圖1)。

2.2 類葉升麻苷在PC12 細胞中誘導HO-1 的表達

20 和30 μmol/L AS 可明顯上調HO-1 mRNA(圖2A，表1)。AS 可以誘導HO-1 蛋白的表達(圖2B，表1)。

圖1 類葉升麻苷對MPP +誘導的PC12 細胞存活率的影響Fig 1 The effect of acteoside on MPP + induced cell viability in PC12 cells(±s，n=3)

圖2 類葉升麻苷誘導PC12 細胞HO-1 的表達Fig 2 Acteoside induces HO-1 expression in PC12 cells(±s，n=3)

表1 類葉升麻苷誘導PC12 細胞HO-1 的表達Table 1 Acteoside induces HO-1 expression in PC12 cells(±s，n=3)

表1 類葉升麻苷誘導PC12 細胞HO-1 的表達Table 1 Acteoside induces HO-1 expression in PC12 cells(±s，n=3)

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with control.

groupHO-1 mRNAHO-1 protein control100 ±18100 ±41 AS 1 μmol/L137 ±26163 ±70 AS 20 μmol/L226 ±48*322 ±67*AS 30 μmol/L339 ±73＊＊380 ±126＊＊

2.3 類葉升麻苷誘導HO-1 蛋白的表達位于胞質內

AS 可在PC12 細胞中誘導HO-1 的表達，而HO-1 的表達升高主要集中在胞質內(圖3)。

圖3 免疫熒光染色顯示類葉升麻苷在PC12 細胞誘導HO-1 蛋白的表達Fig 3 Acteoside induces HO-1 protein expression in PC12 cells by immunochemical staining

2.4 類葉升麻苷通過上調HO-1 表達抑制MPP+誘導的細胞損傷

AS(30 μmol/L)預處理2 h 后，可明顯抑制MPP+所導致的細胞存活率的下降(P＜0.05)(圖4)，而HO-1 抑制劑ZnPP 可以減弱AS 對MPP+誘導細胞損傷的抑制作用(P＜0.05)(圖4)。

圖4 類葉升麻苷通過上調HO-1 表達抑制MPP +誘導的細胞損傷Fig 4 Acteoside protect against MPP + induced neurotoxicity by upregulating HO-1 expression(±s，n=12)

3 討論

血紅素加氧酶-1 (heme oxygenase-1，HO-1)是一個具有保護作用的在應激早期發揮反應的抗氧化酶蛋白，其參與游離血紅素(Heme)降解的限速酶，其分子質量為32 ku，HO-1 催化血紅素產生CO、膽綠素和游離鐵［13］。大量研究表明，其細胞保護作用引起了廣大研究者的注意［10-11］。HO-1 在PD 中具有神經保護作用［14］。最近研究顯示，通過藥理學途徑上調HO-1 表達可抑MPP+引起的神經毒性損傷。蝦青素(astaxanthin)可通過促進HO-1 的表達從而保護PC12 細胞受MPP+介導的NOX2 來源的ROS 氧化損傷［12］。1，2，3，4，6-O-五沒食子酰葡萄糖通過PI3K 和ERK/Nrf2 通路促進HO-1 的表達從而保護PC12 細胞受MPP+介導的氧化損傷［4］。

類葉升麻苷具有神經保護活性。AS 在帕金森病模型中具有神經保護作用，AS 可通過抗氧化和抗凋亡機制抑制MPP+誘導的神經毒性損傷［5-6］。上調HO-1 表達在PD 具有神經保護作用。因此本研究以HO-1 為切入點，研究AS 的新的藥理學作用。發現類葉升麻苷可在體外誘導HO-1 mRNA 和蛋白的表達，進一步免疫熒光染色顯示類葉升麻苷可在PC12 細胞中誘導HO-1 的表達，而HO-1 的表達升高主要集中在胞質內。HO-1 抑制劑ZnPP 可以減弱類葉升麻苷對MPP+誘導細胞損傷的抑制作用，這表明HO-1 表達上調參與類葉升麻苷對MPP+誘導細胞損傷的抑制作用機制。

綜上所述，本研究鑒定出類葉升麻苷為一個新的誘導HO-1 表達的新的化合物。本研究闡明了類葉升麻苷新的藥理作用，即其可通過上調HO-1 的表達抑制MPP+誘導的神經毒性損傷。為進一步探討其抑制氧化應激相關疾病的神經保護作用機制奠定了基礎。

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