C6膠質瘤微環境中大鼠BMSCs惡性轉變與NF-κB高表達的相關性

燕 莎，朱 靜*，田 杰，2，張春敏，譚 彬，崔建邦，楊春梅

(重慶醫科大學附屬兒童醫院1.兒童發育與疾病研究教育部重點實驗室兒科學重慶市重點實驗室;2.心血管內科，重慶400014)

惡性腫瘤的治療一直是醫學研究的熱點，骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)因具有極好的遷移能力和腫瘤趨向性，而被作為是靶向治療腫瘤的最佳載體細胞，然而干細胞在特定的微環境中會有惡性轉變的風險，有文獻報道BMSCs 在異常的微環境中受到多種與腫瘤發生相關的信號通路的調控與影響［1-2］。本研究前期數據已經證實將BMSCs 置于C6 膠質瘤細胞的微環境中會發生惡性轉變［3-5］。NF-κB(nuclear factor-κB，核轉錄因子κB)和STAT3(signal transducers and activators of transcription3，信號傳導與轉錄活化因子3)的高表達及激活與多種腫瘤的發生發展密切相關［6-7］。本實驗將從NF-κB 和STAT3 信號通路的角度出發來探討BMSCs 在C6 微環境中發生惡性轉變的相關機制，為BMSCs 的安全應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF 級SD 大鼠(3～4 周齡、體質量40 ±10 g)，SPF 級SD 24 h 新生鼠均由重慶醫科大學動物中心提供［合格證書SCXY(渝)20120001］)。DMEM/F12 培養基及胎牛血清(Gibico 公司)，胰蛋白酶(Sigma 公司)。0.45 μm 1 次性無菌過濾器(Millipore 公司)。熒光定量PCR 試劑盒(大連寶生物公司)。NF-κB P65、STAT3 和c-Myc 引物(上海英俊生物公司)。大鼠IL-6 ELISA 檢測試劑盒(Westang公司)。抗體:NF-κB P65、STAT3、P-STAT3、c-Myc和CD90(Abcam 公司);CD105(Origene 公司);CD45(Biolegend 公司)。ECL 化學發光試劑盒(南京凱基生物)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs 細胞培養及分組:取大鼠脛骨和股骨骨髓，貼壁法篩選、分離、培養和擴增BMSCs，用含10%胎牛血清DMEM/F12 培養，待細胞增殖至80%～90%匯合以1∶2 傳代培養;取24 h 新生鼠的大腦皮質，差速貼壁法體外分離、培養及擴增星型膠質細胞;C6 膠質瘤細胞系用含10% 胎牛血清DMEM/F12 培養基常規培養。

實驗共分4 組:空白組，10%胎牛血清DMEM/F12 新鮮培養基培養第3 代BMSCs;陰性對照組，星形膠質細胞二次培養液與10%胎牛血清DMEM/F12 新鮮培養基1∶1 比例培養第3 代BMSCs，間接共培養7 d;陽性對照組，10%胎牛血清DMEM/F12培養基培養C6 膠質瘤細胞;實驗組，C6 膠質瘤細胞2 次培養液與含10%胎牛血清DMEM/F12 新鮮培養基以1∶1 比例培養第3 代BMSCs(骨髓間充質干細胞)，間接共培養7 d。

1.2.2 細胞形態學觀察:尼康倒置相差顯微鏡觀察細胞生長狀態，拍照記錄。

1.2.3 流式細胞術(FCM)鑒定BMSCs 表面抗原:第3 代BMSCs 細胞培養至80%～90%匯合后終止培養，胰蛋白酶消化后，10%胎牛血清DMEM/F12培養基終止消化，離心棄上清，PBS 洗兩次后用1 mL PBS 重懸制成單細胞懸液，細胞數量106個，加入單克隆抗體CD45、CD90 和CD29，同時設立同型陰性對照，流式細胞儀檢測細胞表面標志物CD45、CD90 和CD29 的表達。

1.2.4 ELISA 檢測各組細胞上清液中IL-6 表達水平:4 組細胞均增殖至70%～80% 后，棄培養基，PBS 洗兩遍，加入無血清DMEM/F12 新鮮培養基，培養24 h 后取各組細胞上清液，離心取上清后，按照大鼠IL-6 ELISA 檢測試劑盒說明書操作，450 nm處測吸光度值，3 次獨立實驗。

1.2.5 RT-QPCR 檢測NF-κB P65、STAT3 和c-Myc mRNA 的表達情況:根據RNA 提取試劑盒說明書提取各組細胞RNA，并進行反轉錄，反轉產物cDNA進行擴增，反應條件:預變性95 ℃30 s，95 ℃5 s、60 ℃30 s 共39 個循環，每次反應均設空白空，各組樣品設3 個復孔，以β-actin 為內參，將空白對照組的mRNA 表達量設為1，根據據2－ΔΔct計算各組mRNA 的相對表達量，2 次獨立實驗。優化反應條件使目的基因擴增效率達到95%～105%。目的基因的引物序列如下，以β-actin 為內參(表1)。

1.2.6 Western blot 檢測NF-κB P65、STAT3、P-STAT3和c-Myc 蛋白表達水平:取各組細胞107 個，PBS清洗3 次，按蛋白提取說明書分別提取總蛋白及核蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，分裝－80 ℃保存。配制8% SDS-PAGE 膠，按每孔蛋白總量50 μg 依次上樣，電泳后將蛋白濕轉至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗(NF-κB P65 1 ∶1 000、STAT3 1∶1 000、P-STAT3 1∶2 000、c-Myc 1∶2 000、PTEN 1∶2 000、β-actin 1∶4 000)，4 ℃搖床孵育14～16 h，PBST 漂洗3 次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)二抗，室溫孵育2 h，PBST 漂洗3 次，避光條件下加入ECL 顯色劑于凝膠成像系統發光，測定蛋白表達的相對含量。

1.2.7 免疫熒光檢測NF-κB P65、P-STAT3 蛋白的表達:取各組細胞1 ×104個接種于24 孔板中進行細胞爬片，待細胞增殖至50%左右，進行細胞免疫熒光操作。4%多聚甲醛固定15 min，0.5% Triton-X-100 作用10 min，5%牛血清白蛋白(BSA)封閉30 min，分別加入NF-κB P65(1 ∶400)、P-STAT3(1∶200)、c-Myc(1∶100)一抗，PBS 代替一抗設立陰性對照，4 ℃濕盒14～16 h;室溫平衡30 min，PBS洗去一抗，分別加入山羊抗兔熒光二抗(1∶200 稀釋)37 ℃避光孵育1 h，PBS 洗去二抗，DAPI(1∶20)核染室溫15 min，PBS 清洗后，封片，熒光顯微鏡下觀察細胞NF-κB P65、P-STAT3的表達，并拍照記錄，觀察10 個視野，細胞陽性表達率為陽性細胞數/細胞總數。

1.3 統計學分析

采用SPSS17.0 對所得數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，兩個樣本間的比較采用獨立樣本t 檢驗。

2 結果

2.1 BMSCs 表面抗原的鑒定及細胞形態

第三代BMSCs 貼壁生長，長梭型，集落生長折光性差，集落成漩渦狀(圖1A)。CD90 表達率達100%，CD29 表達率占92.5%，CD45 表達率1.4%(圖1B)。

2.2 各組細胞形態學特征

空白組及陰性對照組BMSCs 細胞扁平，呈成纖維樣細胞生長，分布均勻，排列有序(圖2A、B)。實驗組BMSCs 共培養7 天后形態發生顯著改變，細胞變細變長，核質比增大，細胞間粘附性減小。(圖2C)。C6 細胞貼壁性稍差，形態細長，排列紊亂，核質比大(圖2D)。

表1 RT-QPCR 引物序列Table 1 RT-PCR primer sequence of target gene

圖1 BMSCs 表面標志物表達及BMSCs 細胞形態Fig 1 Surface marker expression and morphology of BMSCs(×40)

圖2 各組細胞形態圖Fig 2 Morphology of cells detected by invertedmicroscope(×100)

2.3 ELISA 檢測各組細胞上清液中SIL-6 表達水平

實驗組細胞上清液IL-6 水平(16.7 ±2.9)ng/L高于陰性組(12.6 ±3.1)ng/L 及空白組(12.3 ±3.2)ng/L(P＜0.05)(圖3)。

圖3 各組細胞上清液中SIL-6 水平Fig 3 Expression of IL-6 in each group(ng/L)

2.4 RT-QPCR 檢測NF-κB P65、STAT3 和c-Myc mRNA 的表達量

實驗組細胞間接共培養7 天后其NF-κB P65、STAT3 和c-Myc mRNA 表達量顯著高于陰性組及空白組(P＜0.05)(圖4)。

2.5 Western blot 檢測蛋白表達水平

實驗組細胞培養7 d 后其NF-κB P65、P-STAT3和c-Myc 蛋白表達量顯著高于陰性對照組及空白組(P＜0.05)(圖5)。

2.6 免疫熒光檢測NF-κB P65、P-STAT3 蛋白的表達

NF-κB P65 表達定位于核內，實驗組細胞NF-κB P65 核內陽性表達率為94%高于陰性組3%及空白組0%(P＜0.01)(圖6);實驗組細胞P-STAT3 高表達于核內陽性率達97%，陰性組及空白組細胞核內沒有表達P-STAT3(圖7)。

圖4 各組細胞NF-κB P65、STAT3 和c-MycmRNA 表達Fig 4 Expression of NF-κB P65，STAT3 and c-Myc mRNA in various group by RT-QPCR

3 討論

BMSCs 因具有低免疫原性、腫瘤趨向性、易于基因轉染等優點而被作為靶向治療腫瘤的種子細胞之一，其細胞移植及抗腫瘤治療等相關研究成為干細胞應用的研究熱點［8］。但BMSCs 臨床應用的安全性存在爭議，將干細胞作為載體靶向治療腫瘤過程中，復雜的腫瘤微環境可能會導致BMSCs 的惡性轉變，引發干細胞安全應用的風險［9］。本實驗前期數據表明，BMSCs 在體外與C6 膠質瘤細胞共培養后注射到裸鼠皮下3 個月后形成腫塊，BMSCs 相關癌基因表達增高，例如突變型P53、Cyclin D1、Bclxl 等，這說明與C6 共培養后的BMSCs 發生了惡性轉變［3-5］。為進一步探討BMSCs 惡性轉變機制，本實驗通過富含高水平細胞因子例如IL-6、HGF 等［5］的C6膠質瘤細胞2 次培養液培養BMSCs，模擬異常微環境，探討處于該異常微環境中的BMSCs 是否存在NF-κB 和STAT3 的激活及高表達。

圖5 NF-κB P65，STAT3，P-STAT3，c-Myc 蛋白相對表達量(P-STAT3#為STAT3 磷酸化率)Fig 5 Expression of NF-κB P65，STAT3，P-STAT3 and c-Myc protein in various group

圖6 免疫熒光檢測NF-κB P65 蛋白的表達Fig 6 Expression of NF-κB P65 protein(×200)

圖7 免疫熒光檢測P-STAT3 蛋白的表達Fig 7 Expression of P-STAT3 protein(×200)

NF-κB 和STAT3 相關信號通路是研究腫瘤發生發展的熱點之一，相關文獻證實NF-κB 作為細胞生存和凋亡的重要調控因子，NF-κB 的激活及高表達與許多惡性腫瘤的發生發展密切相關［9］。高水平的IL-6、TNF-α 等可激活NF-κB，同時活化的NF-κB P50/P65 與靶基因結合后引發細胞因子(IL-6、IL-8、TNF-α 等)及癌基因(c-Myc 等)的高表達［11］。且高水平IL-6 可引發STAT3 的磷酸化［5，12］，持續活化的P-STAT3 與多種腫瘤的發生發展密切相關［13-14］。

本實驗結果表明，惡性轉變的BMSCs 上清液中IL-6 水平顯著高于陰性組及空白組，并且共培養的BMSCs 存在NF-κB、STAT3 的激活及c-Myc 的高表達，這與上述文獻報道中腫瘤發生發展的相關過程一致。因此本實驗認為BMSCs 受到C6 膠質瘤細胞分泌的細胞因子持續刺激，引發NF-κB 和STAT3 的活化并與靶基因結合，啟動下游腫瘤相關基因表達，從而引發C6 膠質瘤微環境下的BMSCs 發生惡性轉變，推測高表達的NF-κB 和STAT3 可能是導致BMSCs惡性轉變的重要因素之一，為后續進一步探討BMSCs 惡性轉變的機制打下基礎，也為BMSCs臨床應用的安全性提供科學依據。

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