干擾SULT2B1下調(diào)MMP-2抑制Hepa1-6肝癌細(xì)胞的體外遷移與侵襲

楊曉明，李曉波，殷蓮華

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，寧夏銀川750004;2.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系，上海200032)

基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase，MMP-2)、MMP-9 過(guò)表達(dá)及活性增強(qiáng)引起細(xì)胞外基質(zhì)的降解是肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1］。羥基類固醇硫酸基轉(zhuǎn)移酶(hydroxysteroid sulfotransferases)2B1 (SULT2B1)是一種催化氧化固醇硫酸化反應(yīng)的關(guān)鍵酶。研究表明，SULT2B1 在肝臟中的生長(zhǎng)、分化和代謝中起到重要的調(diào)控作用［2-4］。本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，SULT2B1 可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖［5］。但SULT2B1 能否調(diào)節(jié)MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)水平影響肝癌細(xì)胞的侵襲與遷移能力?本研究以Hepa1-6 細(xì)胞系為研究對(duì)象，探討SULT2B1 與肝癌細(xì)胞侵襲、遷移生物學(xué)行為的關(guān)系，分析其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞系:小鼠肝癌細(xì)胞系(Hepa1-6)源自American Type Culture Collection (ATCC)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑:DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司)、Trizol Reagent(Invitrogen 公司)、RevertAIdTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit #1622(Fermentas 公司)、SYBR GREEN supermix(Bio-rad 公司);BCA-100 蛋白質(zhì)定量試劑盒(上海申能博彩生物科技有限公司)、RIPA 蛋白裂解液(上海碧云天生物)、ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(北京康維世紀(jì))、0.25%胰蛋白酶(杭州吉諾生物公司)、Transwell 24 孔板(Corning Costar 公司)、Matrigel 膠和明膠(Sigma 公司)、SULT2B1 兔多克隆抗體(Abcam 公司)、Tubulin 兔多克隆抗體(Bioworld 公司)、山羊抗兔IgG 抗體、山羊抗兔FITC 標(biāo)記IgG 抗體(Santa Cruz 公司)、DAPI染色液(武漢博士德生物);SULT2B1 慢病毒干擾載體(SULT2B1-LV)和對(duì)照病毒載體(GFP-LV)由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)有限公司合成;引物由上海桑尼公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):Hepa1-6 細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞培養(yǎng)至鋪滿瓶底后用含0.25%的胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞，每3～4 天換液，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2、飽和濕度。

1.2.2 Hepa1-6 細(xì)胞免疫熒光染色:將Hepa1-6 細(xì)胞接種在玻底皿中，4%多聚甲醛溶液固定10 min，PBS 漂洗，0.5% Triton-100 穿孔15 min，1% 牛血清白蛋白封閉30 min，加入SULT2B1 兔多克隆一抗(1∶200)，同時(shí)設(shè)置正常IgG 兔多克隆抗體為代替一抗的陰性對(duì)照，4 ℃孵育過(guò)夜，加入FITC 標(biāo)記羊抗兔二抗，37 ℃孵育30 min，5 μg/mL DAPI 染核2 min，激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖片。

1.2.3 慢病毒干擾載體感染Hepa1-6 細(xì)胞:實(shí)驗(yàn)分設(shè)干擾組和對(duì)照組，根據(jù)病毒滴度，分別于無(wú)血清培養(yǎng)基中加入SULT2B1-LV 和GFP-LV 病毒懸液，感染指數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為100，按照說(shuō)明書操作，混勻后于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.4 Transwell 遷移與侵襲實(shí)驗(yàn):Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)中，在上室中分別加入經(jīng)GFP-LV 和SULT2B1-LV處理的Hepa1-6 細(xì)胞(1 ×105個(gè))，用500 μL 無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)液重懸，下層加入含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。孵育12 h 將小室取出，甲醇固定20 min，PBS 漂洗，每孔加入500 μL 1%結(jié)晶紫染色。PBS 漂洗，用棉簽擦去微孔膜上層未穿過(guò)膜的細(xì)胞，倒置顯微鏡下放大200 倍對(duì)遷移至膜下層的細(xì)胞拍照。膜上的結(jié)晶紫用33%冰醋酸100 μL 洗脫，酶標(biāo)儀在570 nm 處測(cè)定結(jié)晶紫洗脫液的吸光度值反應(yīng)穿膜細(xì)胞數(shù)。Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)中，小室濾膜上室面均勻涂1∶2 的DMEM 稀釋的Matrigel 膠(50 mg/L)，使用前加入少量無(wú)血清的DMEM 培養(yǎng)液，水化，余步驟同Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 明膠酶譜法檢測(cè)干擾SULT2B1 的TCM 中MMP-2 和MMP-9 的活性:Hepa1-6 細(xì)胞經(jīng)載體處理后，更換為無(wú)血清的DMEM 培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，離心，收集細(xì)胞上清作為腫瘤條件培養(yǎng)基(tumor conditioned medium，TCM)。取干擾組和對(duì)照組的TCM 上清各15 μL 于含0.1%明膠的7.5%聚丙烯酰胺凝膠在非變性條件下進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后膠體置于洗脫液(2.5% Trton X-100)中振蕩洗滌后，移入緩沖液(50 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl，10 mmol/L CaCl2，200 mmol/L NaCl，1 μmol/L ZnCl2)中溫育18 h。0.1%考馬斯亮藍(lán)染色，并在脫色液(冰醋酸∶異丙醇∶水=10∶10∶80)中脫色，膠上出現(xiàn)清晰、透亮的負(fù)染條帶，即為明膠酶的活性部位，用Tanon Gis 軟件對(duì)負(fù)染條帶掃描并分析。

1.2.6 Real-time PCR 檢測(cè) Hepa1-6 細(xì)胞中SULT2B1、MMP-2、MMP-9、TIMP2 的mRNA 表達(dá):引物片段由上海桑尼生物有限公司合成(表1)。Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。Realtime PCR 反應(yīng)體系為:cDNA (4 mg/L)5 μL、SYBR GREEN supermi × 10 μL、上下游引物各1 μL、加ddH2O 至20 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s、退火60 ℃30 s、72 ℃延伸30 s，40 cycles。β-actin 作為內(nèi)參照。反應(yīng)結(jié)束計(jì)算實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組基因表達(dá)量。

表1 Real-time PCR 引物序列Table 1 Primer sets used for real-time PCR

1.2.7 Western blot 檢測(cè)Hepa1-6 細(xì)胞中SULT2B1的表達(dá)水平:采用RIPA 裂解緩沖液冰上裂解細(xì)胞，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，10% SDS-PAGE 凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜(PVDF 膜)、封閉后，分別用SULT2B1 抗體(1∶500)、Tubulin 抗體(1∶5 000)孵育，4 ℃冰箱過(guò)夜，次日復(fù)溫0.5 h 后，HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體(1∶2 000)37 ℃孵育45 min，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SULT2B1 在Hepa1-6 細(xì)胞中的表達(dá)與定位

激光共聚焦顯示SULT2B1 主要表達(dá)于Hepa1-6細(xì)胞的胞質(zhì)中(綠色熒光)，胞核無(wú)表達(dá)(圖1)。

圖1 SULT2B1 在Hepa1-6 細(xì)胞中的表達(dá)與定位Fig 1 SULT2B1 expression and localization in Hepa1-6 cells (Scale bar=100 μm)

2.2 慢病毒介導(dǎo)的SULT2B1 干擾載體感染Hepa1-6 細(xì)胞

熒光顯微鏡顯示，感染GFP-LV 和SULT2B1-LV的Hepa1-6 細(xì)胞熒光強(qiáng)度較好，均能穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白(圖2)。

圖2 慢病毒介導(dǎo)的SULT2B1 干擾載體感染Hepa1-6 細(xì)胞Fig 2 Hepa1-6 cell infected wih GFP-LV and SULT2B1-LV (Scale bar=1 000 μm)

2.3 Hepa1-6 細(xì)胞SULT2B1 干擾效果的檢測(cè)

與對(duì)照載體(GFP-LV)相比，干擾載體(SULT2B1-LV)可使SULT2B1 的mRNA 水平降低81.2%(P＜0.05)(圖3A)，蛋白水平降低43.5%(P＜0.05)(圖3B)。

圖3 Hepa1-6 細(xì)胞SULT2B1 干擾效果的檢測(cè)Fig 3 Efficiency of SULT2B1 interfenrence in Hepa1-6 cells

2.4 SULT2B1 干擾抑制Hepa1-6 細(xì)胞的遷移與侵襲

與GFP-LV 對(duì)照組相比，SULT2B1-LV 可使Hepa1-6 細(xì)胞穿過(guò)未鋪和鋪Matrigl 膠的Transwell 小室濾膜的細(xì)胞數(shù)目分別降低53.5%(P＜0.05)(圖4A)和72.5%(P＜0.05)(圖4B)。

2.5 干擾SULT2B1 對(duì)Hepa1-6 細(xì)胞MMP-2、MMP-9、TIMP2 基因表達(dá)水平的影響

與GFP-LV 對(duì)照組相比，SULT2B1 干擾可使MMP-2 的表達(dá)水平降低54.5%(P＜0.05)、TIMP-2的表達(dá)水平升高1.44 倍(P＜0.05)，但不影響MMP-9 的表達(dá)水平(圖5)。

2.6 干擾SULT2B1 對(duì)Hepa1-6 細(xì)胞的TCM 中MMP-2 和MMP-9 活性的改變

與對(duì)照組相比，干擾SULT2B1 的TCM 可使MMP-2 的活性降低60.5%(P＜0.05)(圖6A)，但對(duì)MMP-9 的活性無(wú)明顯影響(圖6B)。

3 討論

SULT2B1 在不同組織中的定位存在差異性。在人T47D 和MCF-7 乳腺癌細(xì)胞中，SULT2B1 主要存在于胞質(zhì)和完整的胞核中［6］。而在人的正常前列腺上皮細(xì)胞，良性前列腺增生，前列腺癌和LNCaP前列腺癌細(xì)胞中SULT2B1 蛋白位于胞質(zhì)中［7］。本研究顯示SULT2B1 主要定位于Hepa1-6 細(xì)胞的胞質(zhì)，這可能與SULT2B1 在不同組織或細(xì)胞中不同的生物學(xué)功能有關(guān)。盡管SULT2B1 與子宮內(nèi)膜癌［8］、乳腺癌［9］、食管癌［10］和肝癌［5］的關(guān)系已有若干報(bào)道，但其作用機(jī)理仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，干擾SULT2B1 主要通過(guò)上調(diào)FAS，抑制BCL2、MYC、降低cyclin B1 的表達(dá)水平及蛋白穩(wěn)定性，引起細(xì)胞周期G2/M 期阻滯，抑制肝癌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖［5］。本研究結(jié)果表明，干擾SULT2B1 可抑制Hepa1-6 細(xì)胞的遷移與侵襲能力，其作用主要與降低MMP-2 的表達(dá)與活性，增強(qiáng)TIMP-2 的表達(dá)水平有關(guān)。

圖4 SULT2B1 干擾抑制Hepa1-6 細(xì)胞的遷移與侵襲Fig 4 SULT2B1 interfenrence suppressed Hepa1-6 cell migration and invasion capability (×200)

圖5 干擾SULT2B1 對(duì)Hepa1-6 細(xì)胞MMP-2、MMP-9、TIMP2 基因表達(dá)水平的影響ig 5 The effect of SULT2B1 interference on the mRNA levels of MMP-2，MMP-9 and TIMP2 in Hepa1-6 cells

圖6 干擾SULT2B1 對(duì)Hepa1-6 細(xì)胞TCM 中MMP-2 和MMP-9 活性的改變Fig 6 Analysis of MMP-2 and MMP-9 activities with SULT2B1 interference conditioned medium in Hepa1-6 cells

MMP-2 和MMP-9 是MMPs 家族中的重要成員，是參與ECM 降解的主要蛋白酶類。研究表明，HCC 中MMP-2 和MMP-9 呈過(guò)度表達(dá)，與HCC 血管的形成、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，高M(jìn)MP-2、MMP-9 表達(dá)的患者預(yù)后不良［11-12］。本研究中，SULT2B1 與MMP-9 關(guān)系不大，主要通過(guò)下調(diào)MMP-2 的表達(dá)，達(dá)到抑制Hepa1-6 細(xì)胞侵襲與遷移的作用。有研究報(bào)道，MMP-2 的表達(dá)與HCC 癌灶大小、臨床分期密切相關(guān)，有侵襲轉(zhuǎn)移的癌組織陽(yáng)性表達(dá)顯著高于無(wú)轉(zhuǎn)移者，提示MMP-2 陽(yáng)性表達(dá)者預(yù)后不良且在肝癌的侵襲及轉(zhuǎn)移中起重要作用［11］。

SULT2B1 下調(diào)MMP-2 抑制Hepa1-6 肝癌細(xì)胞的體外侵襲與遷移，可能是其影響肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的機(jī)制之一，但SULT2B1 調(diào)控MMP-2 表達(dá)的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。

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