Let-7a靶向抑制Ewing肉瘤中CDK6的表達

瞿岱彪，邵 斌，袁志峰，王 芳，余 佳，劉會文*

(1.景德鎮市第一人民醫院骨科，江西景德鎮333000;2.中國醫學科學院基礎醫學研究所北京協和醫學院基礎學院醫學分子生物學國家重點實驗室，北京100005)

MicroRNA(miRNA)是新近發現的在轉錄后水平起調控作用的一類非編碼RNA 分子［1］。一般而言，miRNA 是通過調控其靶基因，并可與轉錄因子、表觀遺傳因子等共同調節各種復雜生命的活動。有研究表明:Let-7 直接調控除RAS 之外的多種細胞周期蛋白，并直接抑制肺癌細胞增殖通路［2］，而在直腸癌細胞系中過表達Let-7a 后，明顯抑制了腫瘤細胞的增殖［3］。說明Let-7 家族在腫瘤細胞惡性表型中起重要的調控作用。然而，越來越多的報道證實miRNA 在Ewing 肉瘤的發展中起重要的作用［4］。因此，探索Let-7a 在Ewing 肉瘤細胞系中的表達情況及其靶基因具有非常重要的意義，可為進一步實驗提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑

寡核苷酸Let-7a 成熟體(Let-7a_mimic)及其對照(Scramble 和mimic_control)(上海吉碼公司);Triol、細胞培養基(McCoy'5A)和胰蛋白酶(Trypsin-EDTA)(Invitrogen 公司);青霉素及鏈霉素、丙烯酰胺、過硫酸銨(AP)和SDS(Sigma 公司);轉染試劑DharmaFECT 1(Thermo 公司);胎牛血清(HyClone公司);單克隆抗體CDK6(EPITOMICS 公司);限制性內切酶(Spe Ⅰ、Mlu Ⅰ和Kpn Ⅰ)(NEW ENGLAND 公司);Hybond-N 尼龍膜(Amersham 公司);PCR 反應體系hs primer start(Takara 公司);SK-ES-1 細胞系(美國模式菌種收集中心)。辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔的二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司);X 線片(柯達公司)。

1.2 細胞培養及分組

SK-ES-1 細胞培養條件為:37 ℃、5% CO2、飽和濕度環境下分別用含10% 胎牛血清的完全培養基McCoy'5A 培養。在轉染前1 天，以合適濃度傳代，使SK-ES-1 細胞在轉染前處于對數增殖期。轉染前1 h，用無血清無雙抗的培養基將細胞重懸，按5 ×105/孔接種于6 孔板中，置37 ℃、5% CO2、飽和濕度環境下的培養箱中培養;將Let-7a-PC/CDK6_WT/CDK6_MUT 與Let-7a mimic/mimic control 和pRL-TK 用DharmaFECT 1 共轉染SK-ES-1 細胞，具體步驟按照DharmaFECT 1 說明書進行。

SK-ES-1 細胞轉染Let-7a scramble，mimic，mimic control，具體轉染方法同上。

1.3 基因的構建

根據Genebank 中CDK6 野生型的部分基因序列設計引物進行擴增，上游引物引入Spe Ⅰ酶切位點(斜體加粗部分)，下游引物引入Mlu Ⅰ酶切位點(斜體加粗部分)，以人類基因組DNA 為模板進行PCR 擴增。按照分子克隆的具體步驟，與通過Spe Ⅰ和Mlu Ⅰ酶切的pMIR-Reporter 載體進行連接，構建成CDK6_WT 質粒。CDK6_MUT 是根據設計好的引物，以CDK6_WT DNA 為模板，采用20 μL反應體系進行35 個循環反應(98 ℃40 s，55 ℃40 s，72 ℃7 min)，最后72 ℃延伸10 min 后收集產物進行電泳鑒定，并利用DNA 凝膠回收試劑盒進行純化回收。CDK6_MUT 突變的引物長度包含有45個堿基對，其中含有Let-7a 結合的突變位點-acgga，上下游引物通過DNAssit 軟件反向互補。最后采用限制性內切酶Kpn Ⅰ于37 ℃消化PCR 擴增的模板4 h 所得。

用于陽性對照質粒是根據Let-7a 成熟序列，設計含有Spe Ⅰ和Mlu Ⅰ酶切位點的堿基序列，通過自身互補、退火，并通過Spe Ⅰ和Mlu Ⅰ酶切位點構建到pMIR-Reporter 載體上。所有構建的載體均經DNA 測序證實。上述引物序列(表1)。

1.4 Northern blot

使用Trizol 提取不同Ewing 肉瘤細胞系和MSCs 的總RNA。使用去離子甲酰胺在55 ℃下進行30 min變性。每泳道30 μg 加入到15%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，后電轉移到Hybond-N 尼龍膜，晾干后進行紫外膠聯，最后置于－80 ℃下進行保存。合成與成熟miRNA Let-7a 序列互補的寡核苷酸并用做于探針，隨后γ-32P-末端標記的miRNA探針加入到管中，并溫育。在雜交之后，將膜按照標準程序洗滌，用濾紙吸干水滴后用保鮮膜封好，－80 ℃下進行放射自顯影，U6 snRNA 用作內參。并以目的RNA/內參照的灰度值來表示結果。

1.5 Let-7a 的real time PCR

提取轉染后的SK-ES-1 細胞，使用Trizol 提取細胞中的總RNA，具體操作按照Trizol 說明書進行。提取的總RNA 測定濃度后，使用反轉錄試劑盒進行cDNA 第一鏈的合成。所用特異性反轉錄引物:內參U6 RT 引物及Let-7a RT 引物參照表2，具體方法按照M-MLV 反轉錄試劑盒說明書進行。采用20 μL反應體系進行兩步法擴增檢測Let-7a的表達效率，相對定量值采用CT 計算［5］，并以U6 snRNA 作為相對定量的內參，引物序列(表2)。

1.6 雙熒光報告基因實驗

通過Targetscan 靶基因預測網站，分析了Let-7a可能的靶基因，然后將預測的靶基因CDK-6 mRNA的3'UTR 區包含Let-7a 結合位點的序列以及突變了結合位點的序列插入到螢火蟲熒光素酶報告載體pMIR-reporterTMLuciferase 的下游，得到質粒CDK6_WT 和CDK6-Mut，按照上述方法共轉染SKES-1 細胞。轉染48 h 后，檢測螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活力，海腎熒光素酶(PRL-TK)作為內參，測定螢火蟲熒光素酶相對活性。此操作按照雙熒光分析系統進行。

1.7 Western blot

收取轉染好的細胞，提取總蛋白，采用BCA 法進行蛋白定量，每泳道加入30 μg 處理的蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳，轉移至PVDF 膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h 后加入兔抗人一抗(anti-CDK6 1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，每次10 min，室溫下加入HRP 標記的羊抗兔二抗(1∶5 000)孵育2 h。TBST 洗膜3 次，每次10 min后，暗室中顯影，蒸餾水終止反應，GAPDH 為內參。并以目的蛋白/內參照的灰度值來表示結果。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 Let-7a 在Ewing 肉瘤細胞系中系低表達

與骨髓間充質細胞(MSCs)相比，在A673、RDES 和SK-ES-1 3 個細胞系中，Let-7a 的表達量明顯降低(P＜0.05)(圖1)。

表1 分子克隆的引物序列Table 1 Primers sequence for cloning

表2 Real-time PCR 引物序列Table 2 Primer sequences for real-time PCR

圖1 在不同的細胞系中Let-7a 表達量變化Fig 1 Expression of Let-7a in different cell lines

圖2 質粒pMiR-report-CDK6 的構建與鑒定Fig 2 Identification of pMiR-report-CDK6

2.2 構建pMIR-reporter-CDK6 3'非編碼區(3'UTR)野生型質粒

電泳顯示在788 bp 處見一明顯擴增條帶(圖2A);然后PCR 產物經Spe Ⅰ和Mlu Ⅰ雙酶切后，電泳結果第4 泳道可見分別為6 440 bp 載體片段和788 bp 大小片段(圖2B)。DNA 測序證實目的基因序列與GeneBank 中的序列完全一致。

2.3 在SK-ES-1 細胞系中過表達Let-7a

在SK-ES-1 細胞系中Let-7a 的表達水平顯著升高(圖3)。其中，瞬時轉染效率達到了50%～60%(P＜0.01)。

2.4 Let-7a 靶向抑制CDK-6 的表達

圖3 SK-ES-1 細胞經過不同的處理后Let-7a相對表達量Fig 3 The relative expression of Let-7a in different treatment of SK-ES-1

通過序列分析，于CDK6 mRNA 的3'UTR 有Let-7a 結合位點(圖4A);野生型CDK6(CDK6_WT)熒光素酶表達水平與對照組相比降低了約40%，(P＜0.05)通過采取“突變”實驗，突變型(CDK6_MUT)熒光素酶表達水平與對照組相比降低了約15%(圖4B);在SK-ES-1 細胞中過表達Let-7a 后，抑制了CDK6 的蛋白的表達水平(圖4C)。

圖4 Let-7a 靶向抑制CDK6 表達Fig 4 Identification of CDK6 as a direct target gene of Let-7a

3 討論

越來越多的報道［6-7］miRNA 是在諸多的惡性腫瘤調控中起重要作用的一類非編碼RNA 分子。上調或者下調miRNA 將會影響腫瘤血管生成和腫瘤的復發、轉移。Let-7 家族作為一個抑癌miRNA 在許多惡性腫瘤中都是低表達的。該實驗Northern blot 證實了與骨髓間充質細胞相比，Let-7a 在Ewing肉瘤中的表達量是明顯下調的。在Ewing 肉瘤中，融合蛋白EWS-FLI-1 直接結合到Let-7a 啟動子，抑制其轉錄活性，從而減少Let-7a 的表達，這是通過調節其靶基因HMGA2 而影響Ewing 肉瘤家族腫瘤的變化［8］。諸多報道證明CDK6 在惡性腫瘤和干細胞中是一種新興的增殖和分化的調節器［9-10］。該實驗以SK-ES-1 細胞作為Ewing 肉瘤的體外模型，尋找Let-7a 潛在的靶基因。通過生物信息預測網站(Target Scan，PicTar，miRanda)發現與遷移、侵襲、轉移和增殖相關的基因超過1 000 個。Let-7a 作為抑癌miRNA 對Ewing 肉瘤最可能是通過調控CDK6而起作用的。CDK6 是細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶家族的成員，在細胞周期的調控中起到非常重要的作用。細胞周期蛋白的表達順序調控細胞周期的正常表達，并且細胞周期蛋白激活細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)，其中一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的磷酸化是細胞周期進程所必需的靶蛋白［11］。有報道證實CDK6 不但在細胞增殖中起非常重要的作用，而且阻礙細胞的分化［12］。這與其他的細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶不同，例如:CDK2和CDK4［13-14］。

本實驗成功構建了野生型質粒(CDK6_WT)及其突變體(CDK6_MUT)和陽性對照質粒(Let-7a_PC)，并經DNA 測序證實目的基因序列與DNA 序列數據庫中的序列完全一致。經雙熒光素酶報告實驗顯示與對照組熒光素酶表達水平相比，CDK6_WT 和CDK6_MUT 分別降低了約40%和15%，這表明Let-7a 與CDK6 3'UTR 存在結合位點。然后利用體外合成的寡核苷酸轉染SK-ES-1 細胞系，通過RT-qPCR 檢測成功過表達了Let-7a，瞬時轉染效率達到了50% －60%。采取Western blot 結果顯示抑制了CDK6 的蛋白的表達水平。因此，CDK6 是Let-7a 靶基因。

綜上所述，本研究通過生物信息軟件分析、雙熒光素酶報告實驗和Western blot 確定了抑癌microRNA(Let-7a)在Ewing 肉瘤細胞系中靶基因，其可能是通過調控細胞周期編碼蛋白CDK6 在Ewing肉瘤的惡性表型中發揮重要作用。這就為后續研究CDK6 的功能和Let-7a 在Ewing 肉瘤發病機制中的信號通路奠定了基礎。

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