重組新城疫病毒rl-RVG抑制A549荷瘤鼠的瘤體生長

嚴玉蘭，賈麗娟，，劉 洋，張 金，張 杰，梁 冰，步雪峰

(江蘇大學1.附屬人民醫院呼吸科，江蘇鎮江212002;2.臨床醫學院內科學，江蘇鎮江212013;3.附屬人民醫院普外科，江蘇鎮江212002)

肺癌被認為是目前對人類健康及生命威脅最大的惡性腫瘤，是當今世界各國常見的惡性腫瘤之一，據2012年美國癌癥研究中心統計的數據顯示，在新發的各種腫瘤中，肺癌的發病率在14%左右，位居第2 位［1］。長期以來，盡管積極采用各種治療方法包括化療、放療及手術等，肺癌患者的5年生存率仍然不足15%［2］。

目前，各國學者致力于研究一種集基因治療、免疫治療于一體的新的生物治療方法，即溶瘤治療。新城疫病毒(newcastle disease virus，NDV)的抗腫瘤作用已經運用于臨床實驗研究，如急性單核細胞白血病、膠質瘤、人卵巢癌、骨肉瘤、乳腺癌及結腸癌等，均顯示有明顯的抑制腫瘤細胞生長作用［3-4］。其在肺癌研究國內外尚少。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌細胞A549(本實驗保存);SPF 級、4周齡、體質量18～22 g 裸鼠［揚州大學比較醫學中心，實驗動物質量合格證:SCXK(蘇)2012-0004］;表達狂犬病毒糖蛋白的重組新城疫病毒(recombinant avirulent NDV LaSota strain expressing the rabies virus glycoprotein，rl-RVG)與NDV 以及雞抗NDV一抗(中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室惠贈);DMEM 細胞培養基及胎牛血清(維森特公司);引物(上海捷瑞生物技術公司合成);反轉錄試劑盒(Fermentas);PCR 試劑盒(北京康維世紀有限公司);TUNEL 原位檢測試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司);小鼠抗狂犬病毒G 蛋白一抗(Santa 公司)，山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗(北京康維世紀有限公司)，兔抗雞二抗(EARTHOX 公司)，兔抗caspase-3，8，9，Bax 和Bcl-2 一抗(博士德公司)。

1.2 荷瘤鼠的建立

取裸鼠30 只，人肺腺癌細胞A549 復蘇后移入含有10%胎牛血清的DMEM 培養基中，37 ℃、5%CO2培養，待細胞增殖至指數增長期，胰蛋白酶消化后用PBS 平衡鹽液配制成5 ×108/mL 濃度的肺癌細胞懸液。給每只小鼠腋下皮下注射0.3 mL 細胞懸液，經10 d 左右，每只小鼠皮下均長出直徑為5～20 mm 的瘤體。

1.3 分組實驗

待荷瘤鼠皮下腫瘤長至5～20 mm 進行感染研究，將皮下成瘤的裸鼠平均分為3 組，每組10 只，隨機分為rl-RVG 組、NDV 組及PBS 組。rl-RVG 組皮下瘤體注射rl-RVG 6 ×108pfu(空斑形成單位)，NDV 組注射NDV 6 ×108pfu，PBS 組瘤體注射PBS液200 μL，每周2 次，持續3 周。自第一次注射日起0、7、14 和21 d 游標卡尺分別測量皮下腫瘤短徑(a)及長經(b)(包括皮膚厚度在內)，根據公式V=a2×b ×0.52 計算瘤體體積，根據末次測量腫瘤體積計算抑瘤率，抑瘤率=(對照組平均腫瘤體積－處理組平均腫瘤體積)/對照組平均腫瘤體積×100%。21 d 時處死全部小鼠，鈍性剝離皮下腫瘤，部分組織4%多聚甲醛固定，部分組織－80 ℃保存待用。

1.4 RT-PCR 檢測RVG 及NDV HN 基因表達

取小鼠新鮮皮下瘤體，Trizol 法提取瘤體組織總RNA，以Oligo dT 為反轉錄引物用Fermentas 反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA 模板，引物分別為:RVG:上游5'-AGCCGATGCACTACAAG-3'，下游5'-CTGGA GGAGGGATGATTGC-3'，擴增長度:175 bp;NDV HN:上游5'-CTGGACGGTTTGGTGGGAA-3'，下游5'-TAATGCGACTGCGGGATGTG-3'，擴增長度:462 bp，進行PCR，PCR 的循環條件:94 ℃熱啟動預變性5 min，94 ℃30 s，53 ℃ 30 s(NDV HN 為55 ℃30 s)，72 ℃30 s，共30 個循環，72 ℃延伸10 min，對擴增產物進行10 g/L 瓊脂糖電泳分析。

1.5 凋亡檢測

取小鼠的部分皮下瘤體組織，4%甲醛固定，石蠟包埋，5 μm 連續切片。用TUNEL 法檢測細胞凋亡。按試劑盒的說明書操作，蘇木素復染，倒置顯微鏡下觀察分析。其中細胞核為棕色的為陽性細胞，在200 ×視野下選擇陽性細胞分布均勻的區域，連續計數100 個細胞，并計數其中陽性細胞，重復3次。凋亡指數(AD = 凋亡細胞數/(凋亡細胞數+未凋亡細胞數)×100%)。

1.6 蛋白印跡法檢測caspase 系列及Bax/Bcl-2

取小鼠新鮮皮下瘤體組織，提取組織蛋白后，行SDS-PAGE 電泳，轉膜后分別使用兔抗caspase-3，8，9，Bax 和Bcl-2 為一抗，稀釋比為1∶500，山羊抗兔IgGHRP 為二抗，稀釋比為1∶10 000，行蛋白質印跡檢測。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 3 周時各組荷瘤裸鼠腫瘤生長狀況

rl-RVG 感染后21 d 時rl-RVG 組和NDV 組腫瘤體積明顯小于對照組，且rl-RVG 組瘤體生長較NDV 組慢(P＜0.05)。rl-RVG 的抑瘤率為54.5%，NDV 的抑瘤率為37.5%(圖1，2)。

圖1 3 周時各組荷瘤裸鼠腫瘤生長狀況Fig 1 Status of tumor growth of experimenting group and control group at third week

2.2 RT-PCR 檢測RVG 及NDV HN 基因表達

3 組均可在496 bp 出現GAPDH 基因條帶(圖3A);rl-RVG 組在175 bp 出現RVG 基因條帶，NDV 組及PBS 組均無條帶(圖3B);rl-RVG 組及NDV 組在462 bp出現NDV HN 基因條帶，PBS 組無條帶(圖3C)。

圖2 3 周各組荷瘤裸鼠腫瘤瘤體積Fig 2 Tumor volume of experimenting group and control group in there weeks(±s，n=10)

2.3 腫瘤組織的細胞凋亡情況

rl-RVG 組及NDV 組凋亡細胞明顯高于PBS組，且rl-RVG 較及NDV 組凋亡細胞較多(P＜0.05)(圖4，表1)。

表1 rl-RVG 感染A549 荷瘤鼠后腫瘤細胞的凋亡指數Table 1 The apoptosis index of tumor infected with rl-RVG(±s，n=10)

表1 rl-RVG 感染A549 荷瘤鼠后腫瘤細胞的凋亡指數Table 1 The apoptosis index of tumor infected with rl-RVG(±s，n=10)

＊P＜0.05 compared with PBS;△P＜0.05 compared with rl-RVG.

groupAI PBS0.034 ±0.028 NDV0.211 ±0.038＊△rl-RVG0.302 ±0.052*

圖3 RVG 及NDV HN 基因表達Fig 3 Expression of RVG and NDV HN gene in the tumor tissues

圖4 rl-RVG 感染A549 荷瘤鼠后腫瘤細胞的凋亡Fig 4 The apoptosis of tumor infected with rl-RVG (×200)

2.4 Western blot 測caspase 系列及Bax/Bcl-2 比值

組織蛋白中表達的caspase-3，8，9 顯示，rl-RVG組及NDV 組表達較PBS 組明顯增多(P＜0.05)，rl-RVG較NDV 組表達增多(P＜0.05);rl-RVG 組及NDV 組Bax 表達高于PBS 組，而rl-RVG 組及NDV組Bcl-2 表達低于PBS 組，rl-RVG 組及NDV 組的Bax/ Bcl-2 吸光度比明顯高于PBS 組(P＜0.05)，且rl-RVG高于NDV 組(P＜0.05)(圖5，表2)。

圖5 Caspase3，8，9，Bax 和Bcl-2 的表達Fig 5 The expression of caspase-3，8，9，Bax and Bcl-2

表2 Caspase-3，8，9 和Bax/Bcl-2 的吸光度比值Table 2 The absorbance ratio of caspase-3，8，9 and Bax / Bcl-2(±s，n=10)

表2 Caspase-3，8，9 和Bax/Bcl-2 的吸光度比值Table 2 The absorbance ratio of caspase-3，8，9 and Bax / Bcl-2(±s，n=10)

＊P＜0.05 compared with PBS;△P＜0.05 compared with rl-RVG.

groupcaspase-3caspase-8caspase-9Bax/Bcl-2 PBS0.46 ±0.110.36 ±0.130.46 ±0.110.46 ±0.15 NDV0.92 ±0.19＊△0.80 ±0.22＊△0.78 ±0.19＊△0.92 ±0.24＊△rl-RVG1.40 ±0.31*1.22 ±0.19*1.24 ±0.29*1.40 ±0.29*

3 討論

肺癌是最常見的惡性腫瘤，中國肺癌的發病率一直呈上升趨勢。溶瘤治療是一種新的生物治療方法，很多種病毒具有溶瘤作用，例如單純皰疹病毒1 型，腺病毒等［5］，NDV 是最常用的，被認為是一個很有潛力的溶瘤病毒。NDV 對腫瘤細胞具有選擇性地復制，并摧毀腫瘤細胞，同時保留正常的細胞，由此可以運用于抗腫瘤的治療中［6-7］。其在肺癌研究國內外尚少。NDV 對于人和動物來說也是一個很有前途的疫苗載體，通過對NDV 進行重組，更有效的作用于腫瘤細胞［8-9］。

新城疫病毒的直接溶瘤作用主要是通過誘導凋亡途徑實現的，誘導凋亡途徑的主要是激活內在的和外在的凋亡通路及激活內質網應激通路［10］。NDV 感染腫瘤細胞后引起腫瘤細胞分泌TNF-α 和TRAIL 激活caspase-8，也可引起腫瘤細胞線粒體膜電位下降，細胞色素C 釋放，引起半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶的次序激活，并激活caspase-9，NDV 凋亡途徑的激活可能是激活線粒體通路及caspase-9，以及后來激活的caspase-8 引起的［11］。

狂犬病毒的基因組為不分節段的單股負鏈RNA［12］，從3'到5'的方向有5 個結構基因［13］。其中狂犬病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein，RVG)在誘導狂犬病毒的凋亡中起著非常重要的作用。減毒的狂犬病毒ERA 株糖蛋白的表達可以觸發人細胞發生涉及caspase-3，8 和9 的活化的細胞凋亡。

成功構建穩定表達狂犬病毒糖蛋白的重組新城疫病毒疫苗(rl-RVG)，RVG 的表達使NDV 在細胞之間的擴散能力增強，使得rl-RVG 更有效的作用于腫瘤細胞;而RVG 的表達不會增強NDV 對老鼠及禽類的毒性［14］。

本實驗運用中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所惠贈的rl-RVG 感染人肺腺癌細胞A549 荷瘤鼠，研究其體內抑制作用及部分機制，結果顯示:組織Tunel 實驗組凋亡細胞明顯增多，表明rl-RVG 可以使腫瘤細胞凋亡增加;檢測caspase-3，8，9 的蛋白表達，結果顯示rl-RVG 組及NDV 組caspase-3，8，9 表達量明顯高于PBS 組，表明rl-RVG 及NDV 誘導腫瘤細胞凋亡的途徑之一是活化了 caspase-8，caspase-9 和caspase-3 蛋白信號通路;檢測rl-RVG及NDV 組Bax 蛋白及Bax/Bcl-2 比值明顯較PBS組的高，表明通過上調Bax 蛋白的表達，Bax/Bcl-2比值增高，進而促進腫瘤細胞凋亡是rl-RVG 及NDV 導致腫瘤細胞死亡的途徑之一。

綜上所述:本實驗明確了重組新城疫病毒rl-RVG 對肺腺癌的荷瘤鼠的腫瘤生長有著明顯的抑制作用，其可能機制與rl-RVG 導致的細胞凋亡有著密切的關系，為進一步研究rl-RVG 在肺癌方面的作用奠定了基礎。

志謝:感謝葛金英及步志高所在的中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室贈與的重組新城疫病毒rl-RVG 與NDV 及技術支持，感謝錢海及陶燕博士給與的技術指導。

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