肌糖蛋白TN－C促進人骨髓基質干細胞向成骨細胞的分化

曹玉凈，呂秋霞

(河南省中醫院創傷骨科，河南鄭州450002

骨折愈合是一個極其復雜的修復過程，受諸多因素的影響，包括全身性因素和局部性因素。怎樣早期促進骨折愈合，一直是骨傷科領域的重點課題之一。在骨折愈合的過程中，骨折部位的血液供應、感染的影響、軟組織損傷程度、骨折端軟組織嵌入等都會影響愈合過程［1］。

肌糖蛋白C(tenascin－c，TN－C)，又被稱為神經膠質/間葉細胞細胞外基質蛋白(GMEM)或肌腱抗原，是由分子質量在190～300 ku 的亞基通過二硫鍵連接的寡聚物。與其他的細胞外基質蛋白如纖連蛋白(fibronectin)和層粘連蛋白(laminin)相比，TN－C 的表達通常是瞬時的，并且高度控制在胚胎發育階段。但在正常或病理的組織重塑時，成體器官的特定組織重新表達TN－C。在組織損傷中，TN－C介導炎性反應和纖維化進程，促進組織的再生修復［2］。近10年的研究發現:TN－C 在心肌和動脈損傷，腫瘤血管再生和腫瘤轉移，以及調節干細胞的行為中有至關重要的作用［3，4］。但對于TN－C 是否能誘導骨再生尚缺乏相關的研究。本研究旨在探討TN－C 對骨再生的影響及潛在的機制，為TN－C 在促進骨折愈合中的應用提供可參考的價值。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM 培養基(Gibco 公司);胎牛血清(FBS)(杭州四季青生物科技公司);0.25%胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素(Hyclone 公司);堿性磷酸酶試劑盒(碧云天公司);BCA 蛋白定量試劑盒(Pierce 公司);骨鈣素放免試劑盒(Immutopics 公司);24 孔細胞培養板和96 孔細胞培養板板(上海生工生物科技有限公司);細胞茜素紅(上海杰美基因醫藥科技公司);cDNA 合成試劑盒、DMSO 和MTT(大連寶生物);鼠抗人TN－C 一抗及羊抗鼠二抗(Sigma 公司);RNAprep 總RNA 提取試劑盒和ECL 發光試劑盒(北京天根生物科技公司);重組人PDE1B(北京義翹神州生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 人骨髓基質干細胞的分離培養與處理:所有材料的獲取按照標準流程在本實驗室高級實驗員的監督下完成。本研究得到河南省中醫院倫理委員會的同意。骨髓由2013年1月至6月于河南省中醫院住院患者志愿捐獻，所有患者均簽訂知情同意書。采用全骨髓培養法，多次消化以純化人骨髓基質干細胞(hBMSCs)。分離純化的hBMSCs 培養在含有10% FBS，100 μg/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養基中，于37 ℃恒溫CO2培養箱中培養［5］。

1.2.2 重組TN－C 的制備:已有研究表明，骨肉瘤細胞MG－63 中TN－C 高表達［6］。因此本研究使用RNAiso 從人骨肉瘤細胞MG－63 中提取總RNA 并進行反轉錄獲取TN－C cDNA。以2 μL TN－C cDNA 作為模板，使用特異性引物進行PCR 擴增TN－C。獲得的TN－C DNA 純化后插入pCDNA3.1(+)載體，并轉染目的細胞人胚腎HEK293A 進行TN－C 的體外表達。重組表達的TN－C 經鎳柱親和層析純化并進行Western blot 檢測其表達。

1.2.3 Western blot 檢測蛋白表達:上述制備純化的rTN－C 經BCA 蛋白定量試劑盒測蛋白的濃度。取蛋白樣品30 μg，進行SDS－PAGE 電泳。電泳結束后，通過電轉移將凝膠上的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上。然后，將膜置于10 mL 現配的封閉液中2%脫脂奶粉，TBS(Tris－buffered saline，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris－HCl，pH 7.5)封閉1 h;依次加入鼠抗人TN－C 一抗(1∶1 000 稀釋)，4 ℃過夜孵育;TBST(TBS 含0.02% Tween)洗3 次，加入HRP偶聯的羊抗鼠二抗(1∶10 000 稀釋)室溫孵育2 h;TBST 洗膜3 次，TBS 洗膜1 次。使用ECL 發光試劑盒檢測TN－C 的表達。

1.2.4 MTT 法檢測細胞增殖能力:取生長良好的hBMSCs 細胞制備細胞懸浮液，計數后以2 ×104個/孔接種于96 孔板，每孔200 μL。待細胞貼壁后，更換含有不同濃度重組TN－C 蛋白的條件培養基并繼續培養。12 h 后，向每孔加入5 g/L 的MTT 儲存液20 μL，繼續培養4 h;棄上清后，加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)，置于低溫搖床低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解，并于酶標儀上測定490 nm 處吸光度值(A)。

1.2.5 細胞茜素紅染色:原代培養8～11 d 后細胞匯合成單層，按1 ∶ 3 的比例傳代，細胞計數后以3 ×105個/孔接種到24 孔培養板中。待細胞匯合度基本達到50%，分別對細胞進行如下處理:實驗組采用含有不同濃度重組TN－C(rTN－C)蛋白的條件培養液(0、1、10、50 和100 nmol/L)處理不同的時間，對照組采用不含TN－C 蛋白的完全培養液。不同處理的細胞培養一定的時間后，用細胞茜素紅對細胞進行染色，檢測hBMSCs 向成骨細胞的分化。

1.2.6 RT－qPCR 檢測ALP 和OCN mRNA 的表達:收集實驗組或對照組細胞，按照RNAprep 培養細胞總RNA 提取試劑盒說明書提取細胞總RNA，按照PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time)試劑盒說明書進行反轉錄獲得cDNA。以獲得的cDNA 為模板進行實時定量PCR，檢測ALP 和OCN 的mRNA水平變化，并以β－actin 作為內參。本實驗所使用的特異性引物序列如下:ALP:正義鏈:5'－GCACCATG ATTTCACCAT－3';反義鏈:5'－CTGGGCCCTCAGAAC AGGAC－3';OCN:正義鏈:5'－CGAGACACCATGAGA GCC－3';反義鏈:5'－GAGCGACACCCTAGACCG－3';β－actin:正義鏈:5'－CAACTTGATGTATGAAGGCTTT GGT－3';反義鏈:5'－ACTTTTATTGGTCTCAAGTCAGT GTACAG－3'。所有引物合成均由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.2.7 ALP 比活性的測定:傳代的hBMSCs 細胞用含有不同濃度TN－C 重組蛋白的條件培養基以5 ×104/cm2接種于6 孔板中，在TN－C 重組蛋白作用的第3、6 和12 d 收集并裂解細胞，按照ALP 試劑盒說明書操作，并用BCA 蛋白定量試劑盒定量總蛋白。計算細胞內ALP 比活性，單位為U/L。

1.2.8 OCN 含量的檢測:傳代的hBMSCs 細胞用含有不同濃度rTN－C 的條件培養基以5 ×104/cm2接種于6 孔板中，在rTN－C 作用后按預計時間收集各組細胞，按骨鈣素放免試劑盒說明書檢測OCN含量。

1.3 統計學分析

采用SPSS 12.0 統計軟件對數據進行t 檢驗，并用Graphpad prism 5.0 作圖。結果用均數±標準差(±s)表示。

2 結果

2.1 重組TN-C 蛋白的檢測

鼠抗人TN－C 抗體能與重組TN－C 蛋白免疫，顯示單一的條帶，而對照組蛋白(本實驗采用含有GST標簽的重組人PDE1B)蛋白未能顯示條帶(圖1)。

2.2 rTN-C 促進hBMSCs 向成骨細胞分化

不同濃度的rTN－C(0、1、10、50 和100 nmol/L)處理hBMSCs 24 h 后，細胞數量無明顯上升(圖2A)。在rTN－C 處理細胞的第10 天，rTN－C 劑量依賴性促進成骨細胞的礦化(圖2B)。

圖1 Western blot 檢測制備的TN-C 重組蛋白Fig 1 Detection of recombinant TN-C by Western blot

圖2 rTN-C 對hBMSCs 增殖及礦化的影響Fig 2 The effect of rTN-C on the proliferation and mineralization of hBMSCs

2.3 rTN-C 對ALP 水平及比活性的影響

不同濃度rTN－C 處理hBMSCs 10 d 后ALP mRNA水平隨rTN－C 濃度顯著上升(P＜0.05)。但在rTN－C ＞50 nmol/L 后，ALP mRNA 水平與50 nmol/L組相比沒有顯著性變化(圖3 A)。

50 nmol/L rTN－C 處理hBMSCs 不同時間(3、6、9 和12 d)后，細胞內ALP 的比活性明顯高于對照組(表1)，并隨誘導時間的延長而繼續顯著增高(P＜0.05)。

2.4 rTN-C 對OCN 的影響

與ALP 類似，與對照組相比不同濃度rTN－C 處理hBMSCs 10 d 后，OCN mRNA 水平隨rTN－C 濃度

顯著上升。但rTN－C ＞50 nmol/L 時，OCN mRNA 水平與50 nmol/L 組相比沒有顯著性變化(圖3B)。50 nmol/L rTN－C 處理hBMSCs 后，OCN 含量隨著處理時間的延長而增加，從處理后第12 d 起實驗組OCN 含量顯著高于對照組(P＜0.05)(表2)。

3 討論

TN－C 是細胞外基質重要成分，最早發現其能調節細胞與纖連素之間的黏附，能被分類為抗黏附和黏附調節蛋白。TN－C 在發育階段和成人中都能調節表達。組織學中觀察到TN－C 在器官形成中短暫表達，而在已經完全發育成熟的器官中則豐度降低或者不表達。但是在一些病理情況下如感染，炎癥和腫瘤情況下表達升高。研究表明TN－C 在調節細胞黏附、遷移和生長，影響腫瘤生長、侵襲、血管形成以及免疫抑制中有重要作用，另外TN－C 還參與炎癥反應與組織重塑。骨折愈合過程是一個復雜而連續的過程，主要包括幾個階段:血腫炎癥機化期、原始骨痂形成期、骨板形成塑形期。患者的年齡、健康狀況、骨折的類型和數量、骨折部位的血液供應、軟組織的損傷程度、軟組織的嵌入和感染等都是影響骨折愈合的重要因素。

鑒于TN－C 在組織重塑、血管再生和炎癥中的重要作用，本研究對TN－C 在骨折愈合中的潛在作用進行了初步的研究，發現rTN－C 能促進骨髓基質干細胞向成骨細胞分化，表現為增加骨基質干細胞堿性磷酸酶含量和骨鈣素含量。

圖3 實時定量PCR 檢測rT-C 處理細胞對細胞內ALP 和OCN mRNA 水平變化的影響Fig 3 RT-PCR were employed to detect the mRNA level of ALP and OCN in cells treated with rT-C

表1 rTN-C 處理的實驗組與對照組細胞ALP 活性測定Table 1 The activity of ALP in control group and experimental group treated with rTN-C(±s，U/L，n=3)

表1 rTN-C 處理的實驗組與對照組細胞ALP 活性測定Table 1 The activity of ALP in control group and experimental group treated with rTN-C(±s，U/L，n=3)

＊P＜0.05 compared with control.

group culture time 3 days6 days9 days12 days control0.179 ±0.0250.210 ±0.0350.224 ±0.043 0.260 ±0.091 experimental0.362 ±0.033*0.561 ±0.022*0.570 ±0.018*0.705 ±0.113*

表2 不同時間OCN 含量的變化Table 2 The content of OCN in cells treated for different time (±s，ng/mL，n=3)

表2 不同時間OCN 含量的變化Table 2 The content of OCN in cells treated for different time (±s，ng/mL，n=3)

＊P＜0.05 compared with control.

group culture time 3 days9 days12 days18 days control0.321 ±0.0640.476 ±0.0610.601 ±0.052 0.790 ±0.091 experimental0.410 ±0.0390.590 ±0.0760.677 ±0.064*0.875 ±0.077*

ALP 是成骨細胞礦化過程中主要的功能活性酶，測定成骨細胞內ALP 活性變化可反應成骨細胞的分化成熟程度和細胞成骨礦化的能力，因此其常作為成骨細胞分化和功能成熟的早期標志分子。ALP 主要存在于胞質中，分解有機質中磷酸，增加局部無機磷酸濃度，促進礦化，在成骨細胞趨向成熟的轉化限制點扮演重要角色。本研究中發現，重組TN－C 蛋白處理人骨髓基質干細胞一定時間后，ALP 活性較未做任何處理的對照組顯著上升。

OCN 在維持正常骨鈣化率和抑制軟骨鈣化中有重要作用，也常用作成骨細胞分化成熟的標志。本實驗結果顯示:在重組TN－C 處理細胞后的第12天開始，實驗組OCN 含量與未做處理的對照組相比差異升高。重組TN－C 對ALP 和OCN 的活性的影響說明其對hBMCs 分化有促進作用。結合重組TN－C 在組織重塑及血管再生中的重要作用，TN－C可能在骨折愈合中有促進血管再生和促進成骨細胞成熟的雙重作用。

［1］秦煜.骨折愈合，延遲愈合和骨不連［J］.中華創傷骨科雜志，2004，6:1059－1062.

［2］Saika S，Sumioka T，Okada Y.Wakayama symposium:modulation of wound healing response in the corneal stroma by osteopontin and tenascin－C［J］.Ocular Surface.2013，11:12－15.

［3］Orend G.，Chiquet－Ehrismann R.Tenascin－C induced signaling in cancer［J］，Cancer letters，2006，244:143－163.

［4］Imanaka－Yoshida K.Tenascin－C in cardiovascular tissue remodeling:from development to inflammation and repair［J］.Circ J，2012，76:2513－20.

［5］王忠，高毅，汪艷，等.人骨髓間充質干細胞分離培養與鑒定［J］.中華神經醫學雜志，2006，10:973－976.

［6］Zheng L，Zhang D，Zhang Y，et al.mTOR Signal Transduction Pathways Contribute to TN－C FNIII A1 Overexpression by Mechanical Stress in Osteosarcoma Cells［J］.Mol Cell，2014，37:118－125.