RNA干擾特異性靶向抑制兔滑膜細胞TNF-α表達

唐 強，廖 琦，郝 亮，蔡 風，彭源祥，劉春龍

(南昌大學第二附屬醫(yī)院骨科，江西南昌330006)

創(chuàng)傷后關節(jié)炎是繼發(fā)于高能量關節(jié)創(chuàng)傷的骨性關節(jié)炎，即便目前有先進的外科干預，仍有40%經歷過嚴重關節(jié)創(chuàng)傷的患者最終發(fā)展為骨性關節(jié)炎，其基因治療關注度越來越高。研究認為TNF-α 是創(chuàng)傷后關節(jié)炎性病理進程中加重軟骨破壞和基質降解最重要的炎性細胞因子之一［1］。

RNA 干擾(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA 誘發(fā)的基因沉默，是高效阻斷哺乳動物細胞內基因表達的最有效方法。慢病毒載體感染效率高，能在傳代細胞中穩(wěn)定表達，對靜止期細胞亦有較高轉染效果。目前利用RNAi 沉默TNF-α 表達的研究報道很少，本研究采用RNAi 方法，構建針對兔TNF-α 的重組慢病毒，探討其抑制兔創(chuàng)傷后關節(jié)炎滑膜細胞中TNF-α 基因的表達，進而為創(chuàng)傷后關節(jié)炎的的基因治療開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑:GV118 慢病毒3 質粒載體系統(tǒng)(上海吉凱基因公司);Lipofectamine 2000 試劑和Trizol 試劑(Invitrogen公司);293T 細胞系和兔創(chuàng)傷后膝關節(jié)炎滑膜細胞(本實驗室原代獲取);Real-time PCR 試劑盒(Toyobo 公司，QPS201);反轉錄試劑盒(Promega 公司);PRISM? 7500 Sequence Detection System(ABI 公司);培養(yǎng)基(Gibco 公司):DMEM-F12和胎牛血清(Hyclone 公司):20%;青鏈霉素(碧云天公司):1%無蛋白干細胞用凍存液(賽業(yè)生物科技公司)，細胞上清液TNF-α ELISA 檢測試劑盒(BD 公司)。

1.2 方法:1)siRNA 的設計與合成siRNA 由銳博生物科技有限公司設計、合成，序列如下:TNF-α-siRNA-A 靶序列5'-GCCTTCAGAACTCCATTCTCAGA-3'，正義鏈:5'-GCCUUCAG AACUCCAUUCUCAGAdTdT-3'，反義鏈:3'-dTdTCGGAAGUC UUGAGGUAAGAGUCU-5';TNF-α-siRNA-B 靶序列5'-TGGT GATTATTGATTATTTATTA-3'，正義鏈:5'-UGGUGAUUAUUG AUUAUUUAUUAdTdT-3'，反義鏈:3'-dTdTACCACUAAUAAC UAAUAAAUAAU-5';TNF-α-siRNA-C 靶序列5'-CACGTTTTC CGTGAAAACAGAGC-3'，正義鏈:5'-CACGUUUUCCGUGAAA ACAGAGCdTdT-3'，反義鏈:3'-dTdT GUGCAAAAGGCACUUU UGUCUCG-5'。2)細胞培養(yǎng)原代細胞取自構建的兔創(chuàng)傷后膝關節(jié)骨性關節(jié)炎模型，獲取原代細胞后，使用多聚賴氨酸處理細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)表面，采用DMEM-F12 培養(yǎng)液(含20%胎牛血清和1%青-鏈霉素)，37 ℃、5% CO2恒溫孵育箱孵育，常規(guī)用0.25%胰蛋白酶消化傳代，用第3～6 代處于對數增殖期滑膜細胞進行實驗。3)重組慢病毒構建與包裝構建如下反應體系合成TNF-α-siRNA-A:10 ×緩沖液2 μL，上下游引物各0.4 μL，dNTP(2.5 mmol/L)0.8 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL，模板1 μL，加入超純水補足20 μL，合成oligo片段，按GV118 慢病毒3 質粒載體系統(tǒng)試劑盒說明，將載體線性化后純化吸收，與上述合成的oligo 片段連接后轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆后擴增提取DNA 片段，線性化后利用Lipofectamine 2000 試劑轉染293T 細胞進行慢病毒包裝并進行滴度測定。同理構建并包裝另外兩組重組慢病毒。4)重組慢病毒感染滑膜細胞感染前1 天將滑膜細胞以1 ×105細胞/孔接種至12 孔細胞培養(yǎng)板中。每孔中加入不含抗生素的培養(yǎng)基，待細胞匯合度達到70%～90%時進行感染，結果分為4 組:NC(陰性對照)、siRNA-A、siRNA-B 和siRNA-C，將上述3 組實驗病毒液同等劑量以最佳感染指數(MOI=20)感染對應組滑膜細胞，NC 組加入等量蒸餾水。培養(yǎng)8～12 h 后，觀察細胞狀態(tài)，更換新鮮完全培養(yǎng)基。置培養(yǎng)板于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。5)Real-time PCR檢測TNF-α mRNA 表達水平提取細胞總RNA:嚴格按照說明書使用TRizol 試劑裂解細胞并提取細胞總RNA。按說明書進行反轉錄反應，所有操作在冰浴條件下進行，20 μL 反應體系徹底混合后，30 ℃孵育10 min，42 ℃孵育60 min，72 ℃孵育10 min，然后使用Real-time PCR 試劑盒進行熒光定量PCR 反應(方法依照使用說明)。冰浴條件下操作，引物徹底混合后放入儀器:ABI PRISM? 7500 Sequence Detection System，使用軟件7500 software v2.0.6 分析，反應程序如下:95 ℃1 min，95 ℃15 s，62 ℃30 s(收集熒光信號)，40個循環(huán)，60 ℃，所有反應設3 個復孔反應，結束后確認熒光定量PCR 的擴增曲線和熔解曲線，結果采用相對定量法分析，目的基因相對表達量利用2－ΔΔCt法進行計算。6)ELISA 檢測細胞上清液TNF-α 收集上述轉染48 h 后細胞上清液，按BD 公司TNF-α ELISA 試劑盒說明書嚴格操作。使用試劑盒提供的標準品按說明書稀釋制作標準曲線，每個樣品進行3 復孔檢測。

2 結果

2.1 TNF-α-siRNA 重組慢病毒構建與包裝:成功構建3 組重組慢病毒，經檢測序列與預期DNA 序列相符，說明合成的TNF-α-siRNA 沉默序列插入正確，重組成功，可以進行后續(xù)實驗(測序經由上海生工生物完成)。慢病毒感染293T 細胞72 h后熒光顯微鏡觀察可見綠色熒光表達(圖1)，siRNA-A、siRNA-B 和siRNA-C 組病毒滴度分別為4.12 ×108、4.25 ×108和4.03×108TU/mL，均滿足慢病毒RNAi 后續(xù)實驗要求。

圖1 重組慢病毒感染293T 細胞72 h 后熒光分布Fig 1 Fluoresence distribution of recombinant lentivirus infected in 293T cells 72 hours postinfection(×100)

2.2 滑膜細胞TNF-α mRNA 表達水平:感染48 h 后，siRNAA 組與siRNA-C 組滑膜細胞TNF-α mRNA 表達較對照組均受到明顯抑制，分別減少55%和65%(P＜0.01)(表1)。

2.3 細胞上清液TNF-α 定量測定的結果:感染48 h 后，siRNA-A組與siRNA-C 組滑膜細胞上清液中TNF-α 表達較之對照組明顯減少(P＜0.01)(表1)。

表1 重組慢病毒感染后滑膜細胞分泌TNF-α及TNF-α mRNA 表達Table 1 The secretion of TNF-αand expression of TNF-α mRNA in synovial cells infected by recombinant lentivirus(±s，n=3)

表1 重組慢病毒感染后滑膜細胞分泌TNF-α及TNF-α mRNA 表達Table 1 The secretion of TNF-αand expression of TNF-α mRNA in synovial cells infected by recombinant lentivirus(±s，n=3)

＊P＜0.01 compared with control.

groupTNF-α(pg/mL)TNF-αmRNA control153.5 ±0.61.00 ±0.00 siRNA-A90.2 ±1.1*0.45 ±0.03*siRNA-B152.5 ±2.11.10 ±0.17 siRNA-C88.9 ±0.5*0.34 ±0.06*

3 討論

基因組學研究顯示，TNF-a 基因組區(qū)間與創(chuàng)傷后骨關節(jié)炎關系密切［2］，在應用動物構建的創(chuàng)傷后骨性關節(jié)炎性反應模型中，發(fā)現早期關節(jié)滑液中幾乎全部可檢測出TNF-α，并且患側滑液中TNF-α 的含量高出健側數倍［3］。目前利用RNA 干擾阻斷TNF-a 表達進而觀察對滑膜細胞作用效果的研究報道很少。

本研究利用慢病毒載體體內表達穩(wěn)定、安全性好的特點，在構建兔創(chuàng)傷后骨性關節(jié)炎模型的基礎上，針對兔TNF-α基因序列成功設計并合成3 組siRNA，并進一步合成了相應重組慢病毒，將重組慢病毒感染滑膜細胞后測定滑膜細胞中TNF-α 基因的表達，顯示有2 組滑膜細胞TNF-α mRNA 表達明顯下降，同時細胞上清液中TNF-α 表達亦明顯受到抑制。雖然siRNA 最有效作用靶點仍有待進一步研究，但本研究證實合理構建的重組慢病毒感染滑膜細胞后能靶向抑制細胞TNF-α 的表達，為臨床以TNF-α 為靶點的創(chuàng)傷后關節(jié)炎基因沉默治療提供了新的方向。

［1］Anderson DD，Chubinskaya S，Guilak F，et al.Post-traumatic osteoarthritis:Improved understanding and opportunities for early intervention［J］.J Orthop Res，2011，29:802-809.

［2］Loughlin J.The genetic epidemiology of human primary osteoarthritis:cuurent status［J］.Expert Rev Mol Med，2005，7:1-12

［3］Aizawa T，Kon T，Einhorn TA，et al.Induction of apoptosis in chondrocytes by tumor necrosis factor‐alpha［J］.J Orthop Res，2001，19:785-796.