藏紅花提取液對慢性高眼壓兔視網膜的影響

曹娟 呂伯昌

西安市第四醫院眼科，陜西西安710004

藏紅花提取液對慢性高眼壓兔視網膜的影響

曹娟 呂伯昌

西安市第四醫院眼科，陜西西安710004

目的建立兔慢性高眼壓模型，分析藏紅花提取液對慢性高眼壓兔眼視網膜的作用效果。方法選取120只新西蘭家兔，隨機分為對照組、高眼壓模型組以及干預治療組，每組40只共80眼。高眼壓模型組以及干預治療組家兔通過注射復方卡波姆溶液建立慢性高眼壓模型，干預治療組家兔每日靜脈推注藏紅花提取液。在建立模型后的7 d、14 d以及4周，各組分別處死10只動物，利用光鏡觀察視網膜形態學變化，并檢測視網膜超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）以及視網膜神經節細胞（RGCs）水平，對結果進行統計學分析。結果高眼壓模型組及干預治療組視網膜均發生腫脹、萎縮，與高眼壓模型組相比，干預治療組損傷程度較輕；建立模型7d時，高眼壓模型組及干預治療組SOD值明顯低于對照組，MDA含量顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），但干預治療組指標變化幅度明顯小于高眼壓模型組（P＜0.05）；建立模型14 d時，高眼壓模型組及干預治療組SOD明顯恢復，接近正常水平，MDA含量仍高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；干預治療組RGCs數目為（287.62±23.54）個，與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），高眼壓模型組RGCs數目為（62.78±10.24）個，顯著低于對照組及干預治療組，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論藏紅花提取液能夠保護慢性高眼壓兔眼視網膜功能，可作為青光眼的有效治療藥物。

藏紅花；眼高壓；視網膜；超氧化物歧化酶；丙二醛；視網膜神經節細胞

青光眼作為臨床常見眼病之一，主要特征為視神經萎縮和視野缺損，視神經節細胞調亡以及神經纖維病變是引發視神經功能損害的主要病理基礎[1-2]。藏紅花提取液是羥自由基與超氧自由基的強效清除劑，能夠抗氧化反應[3]，改善線粒體功能，抑制視神經細胞凋亡[4]。本文著重分析藏紅花提取液對慢性高眼壓兔眼視網膜超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）以及視網膜神經節細胞（RGCs）水平影響，現將結果總結報道如下：

1 對象與方法

1.1 實驗動物

健康成年清潔級新西蘭家兔120只，體重2000～2500 g，雌雄兼用。實驗前應用裂隙燈顯微鏡以及眼底鏡檢查雙眼證實雙眼眼壓以及視網膜正常，未發現眼部疾病。采用抽簽法隨機分為對照組、高眼壓模型組以及干預治療組，每組各40只家兔。遵循中國科學技術委員會制訂的《實驗動物管理條例》進行實驗操作。各組實驗動物的體重、飼養方式、兔齡差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑及儀器

復方卡波姆溶液（上海申興制藥廠生產的卡波姆-940+山西雙鶴藥業生產的地塞米松）；丁卡因滴眼液（遼寧中醫藥大學實驗室）；氯霉素滴眼液（武漢天天明藥業有限責任公司，批號：國藥準字H34024067）；速眠新注射液（解放軍農牧大學軍事獸醫研究所）；藏紅花（遼寧中醫藥大學附屬醫院藥劑科）；SOD分析試劑盒（南京建成生物工程研究所）；MDA分析試劑盒（南京建成生物工程研究所）；立式壓力蒸汽滅菌器、電子天平、低溫高速離心機、流式細胞分析儀、分光光度計以及共聚焦顯微鏡等均由遼寧中醫藥大學實驗室提供。

1.3 藏紅花提取液制備

稱取15 g藏紅花，加蒸餾水煮沸后過濾2次，減壓濃縮濾液，添加950 mL/L乙醇（濃縮濾液與乙醇比例為1∶3），沉淀24 h，再次過濾，濾液經減壓蒸餾對乙醇進行回收后，稀釋到100 mL裝瓶，蒸汽滅菌后放置在冰箱中（-4℃）保存，實驗時稀釋成50 g/L。

1.4 模型制備

參照文獻[5]進行慢性高眼壓模型制備。高眼壓模型組以及干預治療組新西蘭家兔耳緣靜脈注射速眠新（劑量標準為每公斤0.1 mL），全身麻醉后應用5 g/L丁卡因滴眼液行雙眼表面麻醉，用1 mL注射器在角膜緣穿刺形成小針孔，在小針孔對側角膜緣穿刺，抽出0.2 mL房水，注入復方卡波姆溶液0.2 mL，制成慢性高眼壓模型。實驗期間眼壓范圍應為32～39 mm Hg[6]（1 mm Hg=0.133 kPa），并持續4周。對照眼僅采取前房穿刺。

1.5 用藥方法

每日上午8∶00～9∶00干預治療組固定新西蘭白兔后耳緣靜脈注射藏紅花提取液，劑量為40 mg/kg；高眼壓模型組和對照組給予生理鹽水，每日1次。高眼壓模型組和干預治療組每日測量眼壓，如果出現眼壓低于32 mm Hg，則持續注入復方卡波姆溶液。1個月為1個療程。

1.6 檢測指標及方法

成功建模后7 d、14 d及4周各組分別選取10只動物進行空氣栓塞處死，處死動物后立即摘除雙側眼球，去除晶狀體及玻璃體，剝取視網膜，觀察視網膜的形態學改變，并檢測SOD、MDA水平以及RGCs。

1.6.1 視網膜形態學觀察摘除大鼠眼球，應用4%中性甲醛溶液進行固定后，剪除角膜及晶狀體，采用乙醇脫水以及二甲苯透明，石蠟包埋后采取矢狀切片，常規蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察視網膜形態學變化。

1.6.2 SOD活性檢測應用黃嘌呤氧化酶法。視網膜組織勻漿經離心（3500 r/min）處理10 min，留取上清液檢測SOD活性。測定管及對照管分別加入試劑或樣品，充分混勻后放置在37℃水浴箱中作用40 min，加入顯色劑后混勻，靜置10 min倒入光徑比色杯中，在波長550 nm處用蒸餾水調零，比色測定各樣本A值，依據公式計算SOD活性。

1.6.3 MDA含量檢測應用TBA比色法。離心（3500 r/min）處理視網膜勻漿10 min，取上清液待測。標準管、標準空白管以及測定管中分別加入TBA或樣品，旋渦混勻器混勻后，用保鮮膜扎緊試管口，刺一小孔，放置在水浴箱中（95℃）作用40 min后取出，流水冷卻，離心（3500 r/min）處理10 min，取上清液置入光徑比色杯，在波長532 nm處采取蒸餾水調零處理，比色測定A值，按公式計算MDA含量。

1.6.4 RGCs數目檢測慢性高眼壓持續4周時，新西蘭白兔應用大劑量速眠新注射液進行耳緣靜脈內注射，深度麻醉后，摘取眼球，縫線定位角膜緣的6點以及12點鐘位置，剪除角膜、虹膜、晶體以及玻璃體，將剩余眼球壁置于Bouin液中固定，24 h后應用二甲苯進行透明處理，常規浸蠟、石蠟包埋、切片（均通過視乳頭、6點鐘以及12點鐘方位）、染色以及封片，制成光鏡切片后，利用HPIAS-1000圖象測量系統計數RGCs數目，同時對視乳頭兩側5 cm范圍內的RGCs數目進行測量。

1.7 統計學方法

應用SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；相關性分析用Pearson檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 視網膜形態學改變

建模14 d后觀察各組視網膜形態學改變，對照組：視網膜組織結構清晰，細胞核呈圓形或卵圓形，邊緣清晰（圖1A）；高眼壓模型組：視網膜全層高度水腫，神經纖維層、外內叢狀層明顯水腫，細胞核腫脹，周圍可見空泡變性（圖1B）；治療干預組：視網膜內叢狀層發生腫脹，視網膜可見輕度萎縮，與高眼壓模型組相比，程度較輕，內外核層密度較大（圖1C）。

圖1 建模14 d后各組視網膜形態學觀察（HE，400×）

2.2 各組SOD活性及MDA含量比較

建模7 d時，高眼壓模型組及治療干預組SOD值明顯降低，MDA含量顯著上升，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），但干預治療組SOD值明顯高于高眼壓模型組，MDA含量顯著低于高眼壓模型組（P＜0.05）；建模14 d時，高眼壓模型組及干預治療組SOD明顯上升，與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），但是MDA含量仍高于正常水平，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組SOD活性及MDA含量比較（x±s）

2.3 各組RGCs數目比較

建立模型4周后觀察各組RGCs數目，對照組：未見明顯損害，細胞具有完整結構，細胞核呈單層均勻排列，未見細胞丟失，RGCs數目為（303.69±24.87）個（圖2A）；高眼壓模型組：可見損害嚴重，發生節段性丟失，可見部分體積腫大及空泡樣變性細胞，殘存細胞大小不等，細胞核變小，出現核固縮，RGCs數目為（62.78±10.24）個（圖2B），與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；干預治療組：損傷現象不明顯，細胞呈單層線狀的均勻排列，未見明顯細胞丟失征象，RGCs數目為（287.62±23.54）個（圖2C），與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 建模4周后各組RGCs情況觀察（HE，400×）

3 討論

高眼壓作為青光眼的主要獨立危險因素[7-10]，能夠顯著增加致盲性眼病青光眼發生風險。而隨著臨床關于青光眼的深入研究，其相關病理機制研究證實，青光眼視神經損害的主要機制為視網膜神經節細胞發生進行性死亡，視神經纖維發生丟失。目前已知的對青光眼視神經節細胞凋亡具有促進作用的因素主要為神經營養因子剝奪、毒素興奮性增加、細胞內鈣離子超載、一氧化氮代謝紊亂、氧自由基過量、內皮素增多、細胞凋亡基因表達上升以及自體免疫機制異常等[11-13]。并且自由基對細胞衰老過程、小梁網細胞組成結構以及退行性改變具有重要影響。目前抑制視神經細胞凋亡、保護視神經已經成為臨床防治青光眼的主要手段之一。SOD作為抗過氧化物酶之一，能對超氧陰離子歧化反應起催化作用，是活性氧的主要防御屏障，SOD活性降低，將導致自由基堆積。MDA作為脂質過氧化反應指標，能夠損傷視網膜組織。

中藥研究發現，藏紅花不但鎮靜、祛痰、解痙、活血效果顯著，而且具有良好的抗氧化、保護神經元作用。藏紅花作為臨床常用中藥之一，主要功效為行氣活血、祛瘀化痰。現代研究證實[14]，藏紅花不僅能夠抗腫瘤、抗氧化、降血脂、改善微循環，而且能夠清除自由基，具有強效超氧化物清除活性，能夠調節眼部血液血循，恢復視網膜功能。藏紅花提取液有擴張血管、改善微循環的作用，可改善慢性高眼壓導致的視網膜視神經缺血程度，顯著保護視神經細胞[15]。

本實驗中，在建立兔慢性高眼壓模型的基礎上，檢測SOD活性、MDA含量以及RGCs數目，通過與正常兔和模型兔比較，證實了藏紅花提取液能夠顯著減輕視網膜損傷程度，提高SOD活性，降低MDA含量，顯著抑制視神經細胞凋亡。

綜上所述，藏紅花提取液能夠降低慢性高眼壓導致的視網膜損傷，具有保護視網膜功能的作用，值得臨床深入探討。

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Influence of saffron extract on the retina of rabbit with chronic ocular hypertension

CAO JuanLU Bochang
Department of Ophthalmology,the Fourth Hospital of Xi'an City,Shaanxi Province,Xi'an710004,China

Objective To establish a rabbit model of chronic ocular hypertension,analyze saffron extract effects for retina of rabbits with chronic high intraocular pressure.Methods 120 New Zealand rabbits were randomly divided into control group,model group and high IOP intervention group,40 cases(80 eyes)in each group.Ocular model group and intervention group were established rabbits chronic ocular hypertension model by injecting carbomer solution,rabbits in the intervention group were given daily intravenous injection of saffron extract.After model establishment for 7 d,14 d and 4 week,each group were sacrificed 10 animals.Retinal morphological changes were observed by light microscope, then superoxide dismutase(SOD),malondialdehyde(MDA),retinal ganglion cells(RGCs)levels were detected.The results were analyzed.Results The retinal had swelling,shrinking in the intervention group and model group,compared with the model group,the degree of damage was less in the intervention group.After model establishment for 7 d,SOD levels in the model group and intervention group were significant lower than the control group,and MDA levels in the model group and intervention group were significant higher than the control group,with statistically significant difference(P＜0.05),but the rangeability in the intervention group was less than the model group(P＜0.05).After model establishment for 14 d,SOD levels in the model group and intervention group had recovered to normal level,but MDA levels still higher than the control group,with statistically significant difference(P＜0.05).The number of RGCs in the intervention group was(287.62±23.54),compared with the control group,the difference was not statistically significant (P＞0.05).The number of RGCs in the model group was(62.78±10.24),which was significantly lower than the intervention group and the control group,with statistically significant difference(P＜0.05).Conclusion Saffron extract can protect retinal function of rabbits with chronic high intraocular pressure,can be used as an effective therapy for glaucoma. [Key words]Saffron;Ocular hypertension;Retina;SOD;MDA;RGCs

R285.5

A

1673-7210（2014）09（a）-0004-04

國家自然科學基金資助項目（編號81273902）。

曹娟（1981-），女，陜西西安人，碩士；研究方向：青光眼、白內障。