桑葉對腫瘤血管生成的影響

王志雄等

[摘要] 目的 研究桑葉對腫瘤血管生成中血管內皮細胞增殖、遷移和管腔形成的影響。 方法 用CCK-8試劑盒測定HUVEC-2C細胞數量的變化；用Transwell轉移小室研究HUVEC-2C細胞遷移情況；用包被Matrigel的24孔板來培養HUVEC-2C細胞觀察其管腔形成情況。實驗分為實驗組和對照組，每組分別設置3個復孔，在實驗組中加入桑葉浸出液。觀察桑葉對腫瘤血管生成的影響。 結果 桑葉液可抑制HUVEC-2C細胞的增殖能力，抑制作用隨著濃度的增長而增強。在濃度為100、50、25 mg/mL時，與對照組比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。當濃度為100 mg/mL的桑葉液時細胞增殖抑制率可達到37.6%。通過觀察Transwell小室，與對照組比較，添加了桑葉液的HUVEC-2C細胞，其遷移能力受到一定的制約作用。Matrigel實驗中，與未加入桑葉液的HUVEC-2C細胞所形成的較完整的環狀結構比較，加入桑葉液的HUVEC-2C細胞在管腔形成方面受到明顯的抑制作用。 結論 桑葉液通過抑制血管內皮細胞增殖、遷移和管腔形成，對腫瘤血管的生成具有抑制作用。

[關鍵詞] 桑葉；腫瘤血管；內皮細胞；增殖；遷移；管腔形成

[中圖分類號] R282.71 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）09（a）-0022-04

[Abstract] Objective To study the influence of mulberry on vascular endothelial cell proliferation and migration as well as lumen forming in tumor angiogenesis. Methods The change of HUVEC-2C cell quantity was measured with CCK-8 kit； HUVEC-2C cell migration was studied in Transwell chamber； HUVEC-2C cells were cultured in a 24-pore plate coated with Matrigel to observe its lumen forming. The experiment consisted of experiment group and control group， with three complex holes set for each group. Mulberry leachate was added to the experiment group. The effect of mulberry leaf to tumor angiogenesis was observed. Results Mulberry leachate could inhibit the proliferation ability of HUVEC-2C cell， with the inhibiting effect strengthened as the concentration increases. When the concentration was 100， 50， 25 mg/mL， the difference between the experiment group and the control group had statistical significance （P < 0.05）. When the concentration was 100 mg/mL， the cell proliferation inhibiting ratio of mulberry leachate could reach 37.6%. Observation on Transwell chamber showed the follows： added with mulberry leachate， the HUVEC-2C cells′migration ability was inhibited to some extent compared with the control group. In Matrigel experiment， compared with the comparatively complete cyclic structure formed by HUVEC-2C cells without mulberry leachate， the HUVEC-2C cells added with mulberry leachate were obviously inhibited in term of lumen forming. Conclusion Mulberry leachate has inhibiting effect on tumor angiogenesis by inhibiting vascular endothelial cell proliferation and migration as well as lumen forming.

[Key words] Mulberry leaf； Tumor angiogenesis； Endothelial cells； Proliferation； Migration； Lumen formation

1971年，Folkman[1]首次提出血管生成與腫瘤生長之間的關系問題。隨后許多研究陸續證明，腫瘤形成初期，腫瘤細胞能夠通過彌散方式獲取營養物質。但長到一定大小后，必須從最近的血管處誘導形成自身血管。如果沒有血管生成這一過程，腫瘤就會因得不到足夠的營養和氧氣而進入休眠階段，甚至壞死[1]。血管為腫瘤生長提供營養和氧氣，也是其排泄的通道，更是轉移的必要條件[2]。這就為治療腫瘤提供了一個新思路——通過阻斷腫瘤血管的生長，切斷腫瘤營養與氧氣的供應，從而抑制腫瘤的發生和發展。腫瘤血管與正常血管存在很大差異，但無論是腫瘤血管還是正常的血管，血管內皮細胞（endothelial cell）都是血管的主要組成部分，襯貼于血管內壁。

目前，市場上銷售的血管生成抑制藥物大都成本高昂，作用途徑比較單一，治療不夠徹底，副作用仍然較大，在實際應用中存在一些問題。近年來，隨著人民生活水平的提高，飲食結構發生了顯著變化，世界各地相關學者專家都在極力尋求天然、安全、保健性食品藥品的開發，這種回歸自然的愿望已成為走向21世紀的趨勢。探尋引起不良反應小的植物成分藥已成為血管生成抑制劑發展的重要方向[3]。特別是低價易得植物材料，不但可以解決惡性腫瘤早期防治問題，同時也可充分降低治療成本，給更多癌癥患者提供更大的生存機會。

桑葉，作為古老的中藥，其味甘、性平、寒，具有清肝明目聰耳，鎮靜神經，潤肺熱，止咳的作用。近年來，有關學者致力于對天然、安全、保健性藥食品的開發，通過對桑葉化學成分及生理功能的研究，發現其含有的黃酮類、生物堿等生物活性成分，具有降血糖、降血壓、降血脂、抗炎、抗衰老等功效，還能預防腫瘤細胞的生成[4-8]，被國家衛生和計劃生育委員會列為藥食兩用植物。特別是類黃酮中的槲皮素能夠抑制多種腫瘤細胞的分裂增殖，通過多種途徑促進其凋亡，抑制腫瘤細胞遷移及侵襲，降低其耐藥性等作用[9-13]。筆者從血管生成抑制方面來研究桑葉中有效成分對腫瘤生長的影響。

本課題通過探討低價易得植物材料桑葉中的有效成分對腫瘤血管內皮細胞增殖、遷移以及管腔形成的作用，來探索其對腫瘤血管生成的抑制作用，判斷桑葉有效成分抑制腫瘤血管生成的可行性，從而為腫瘤早期預防和治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

桑葉（日本株式會社黑姬和漢藥研究所）；HUVEC-2C（Cascade biologics公司，批號C-003-2C）；PBS（pH為7.4，實驗室配制）；DMEM高糖培養基（Biowest公司提供）；細胞消化液（Trypsin 0.25%-EDTA 0.02%，Biowest公司提供）；胎牛血清（South America Origin，Biowest公司提供）；雙抗（青霉素-鏈霉素，碧云天生物研究所提供）；CCK-8（上海博谷公司）；Matrigel（威格拉斯生物公司提供）。

1.2 實驗設備

超凈工作臺（SW-CJ-1B，蘇州安泰）；電子天平（FA2104，上海舜宇恒平）；二氧化碳培養箱（CP-ST100A，長沙長錦科技）；超聲處理儀（JY92-ⅡDN，寧波新芝生物科技股份有限公司）；旋轉蒸發器（RE-52CS，上海雅榮生公司）；酶標儀（DNM-9602G北京普朗公司）；倒置生物顯微鏡（LWD200-37T，上海測維光電）等。鑷子；手套；無菌針管；0.22 μm針頭過濾器；2 mL PE試管；50 mL離心管；燒杯；量筒；雙蒸水；培養皿；離心管；25 mL細胞培養瓶（Corning）；96孔細胞培養板（Corning）；3 mL巴氏吸管（Corning）；Transwell轉移小室（Corning）；血球計數器。

1.3 方法

1.3.1 桑葉有效成分的提取[14-15] 精確稱取桑葉粉3.00 g，浸泡于60 mL 75%的乙醇中。在50℃、20～25 kHz超聲頻率下超聲30 min后過濾，并將濾渣用60 mL 75%的乙醇再次超聲30 min。將得到的兩次濾液合并超聲混勻，再用0.45 μm的濾紙過濾。濾液用旋轉蒸發器在0.08 mPa、60℃的環境下蒸發2.5 h以去除乙醇，得到的溶液定容至30 mL。之后使用0.22 μm的一次性針頭過濾器過濾除菌，最終得到的桑葉液濃度為100 mg/mL，依次兩倍梯度稀釋至50、25、12.5 mg/mL。

1.3.2 細胞培養 實驗中HUVEC-2C用配制好的DMEM高糖培養基（含10%胎牛血清，1%雙抗）進行培養，用含0.25%胰蛋白酶（0.02% EDTA）消化傳代。二氧化碳培養箱環境設置為5%CO2，37℃。

1.3.3 增殖實驗 取對數生長期HUVEC-2C，進行消化、計數，控制細胞數量至5×104個/mL。在96孔板中設實驗組（100、50、25、12.5 mg/mL）、陽性對照組、陰性對照組，每組設3個復孔，在實驗組和陽性對照組中分別加入每孔100 μL的細胞懸液，陰性對照組加入100 μL培養基。在96板內培養HUVEC-2C 8 h直至細胞完全貼壁。在實驗組中分別加入10 μL不同濃度桑葉制備液（100、50、25、12.5 mg/mL），陽性對照組、陰性對照組加入10 μL無血清的培養基。培養24 h之后將96孔板置于倒置顯微鏡下觀察，發現細胞無異常生長情況，再在每孔中加入10 μL CCK-8檢測試劑，1 h后用酶標儀在單波長450 nm處檢測OD值。OD值與細胞密度成正比，OD值越大說明細胞密度越大，反之則越小。

1.3.4 遷移實驗 取對數生長期HUVEC-2C，進行消化、重懸后計數，調整細胞數量至1×106/mL。在Transwell轉移小室的上室每孔加入200 μL細胞懸液，下室加600 μL無血清DMEM培養基。細胞培養8 h后，在實驗組的下室加100 μL濃度為100 mg/mL的桑葉浸出液，對照組加100 μL無血清DMEM培養基，每組設3個復孔。將Transwell轉移小室置于5%CO2，37℃二氧化碳培養箱中培養8 h后，用PBS清洗小室內側，棉球擦去上室內側中的細胞。小室外側細胞用無水酒精固定30 min，結晶紫染色30 min。洗凈后置于倒置生物顯微鏡下觀察、拍照并分析。

1.3.5 管腔形成實驗 用每孔100 μL的Matrigel包被24孔板，室溫下放置30 min使Matrigel凝固。取出對數生長期的HUVEC-2C，消化、重懸后計數，調整細胞數量至5×105/mL。實驗組和對照組每孔接種500 μL細胞懸液。此外，對照組不加桑葉浸出液，實驗組加50 μL濃度為100 mg/mL的桑葉浸出液，每組設置3個復孔。將24孔板放入5%CO2，37℃培養箱中培養，8 h后置于倒置生物顯微鏡下觀察，隨機選3個視野拍照。

1.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS 17.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。其中細胞增殖的抑制率（%）=1-實驗組/對照組×100%。

2 結果

3 討論

正常環境下，血管生成是一個高度有序的過程，只有生長組織有所需求時，才會誘導單層靜態內皮細胞分化及血管網絡伸展。而腫瘤細胞可以通過模擬正常血管生成過程形成自身血供。腫瘤血管生成主要是通過分泌促血管生長因子，誘導內皮細胞異常增殖、遷移和形成管腔[16]。

桑葉液具有抑制內皮細胞系增殖的能力，抑制作用隨著濃度的增長而增強。通過觀察Transwell小室，與對照組相比添加了桑葉液的內皮細胞系，其遷移能力受到一定的制約作用。Matrigel實驗中，與未加入桑葉液的內皮細胞系所形成的較完整的環狀結構相比，加入桑葉液的內皮細胞系在管腔形成方面受到明顯的抑制作用。實驗表明，桑葉液通過抑制血管內皮細胞增殖、遷移和管腔形成，對腫瘤血管的生成具有抑制作用，從而為其制約腫瘤血管生成、切斷營養與氧氣供給和廢棄物排泄通道、促使腫瘤細胞凋亡提供有力佐證。本研究為桑葉在腫瘤早期預防和治療中的應用提供了實驗依據，使腫瘤早期防治和低成本治療成為可能。

關于本研究只進行了大量的定性實驗，得出桑葉具有抑制血管生成的功效，具體程度尚不明確，且桑葉中的有效組分未知，在之后的研究中將就以上兩個方面進一步給予探討。

[參考文獻]

[1] Folkman J. Tumor angiogenesis： therapeutic implications [J]. The New England Journal of Medicine，1971，285（21）：1182-1186.

[2] Kerbel RS. Tumor angiogenesis：past， present and the near future [J]. Carconogenesis，2000，（21）：505.

[3] 徐韜，許瑞安.中藥及其有效成分抗腫瘤作用機制研究進展[J].華僑大學學報，2009，30，（4）：359-365.

[4] 張舉，肖更生，聊森泰，等.桑葉綜合利用進展[J].廣東蠶業，2003，4（1）：38-41.

[5] 王芳，勵建榮.桑葉的化學成分、生理功能及應用研究進展[J].食品科學，2005，26（1）：111-116.

[6] 歐陽臻，陳鈞.桑葉的化學成分及其藥理作用研究進展[J].江蘇大學學報：自然科學版，2003，24（6）：39-43.

[7] 何雪梅，廖森泰，劉吉平.桑葉的營養功能性成分及藥理作用研究進展[J].蠶業科學，2004，30（4）：390-393.

[8] 張春麗.中藥對腫瘤血管生成抑制作用的研究[J].北京中醫藥，2011，30（2）：156-160.

[9] Wachter J，Neureiter D，Alinger B，et al. Influence of five potential anticancer drugs on wnt pathway and cell survival in human biliary tract cancer cells [J]. Int J Bid Sci，2012，8（1）：15-29.

[10] Qin Y，He LY，Chen Y，et al. Quercetin affects leptin and its receptor in human gastric cancer MGC-803 cells and JAKSTAT pathway [J]. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi，2012，28（1）：12-16.

[11] Senthilkumar K，Arunkumar R，Elumalai P，et al. Quercetin inhibits invasion，migration and signalling molecules involved in cell survival and proliferation of prostate cancer cell line （PC-3） [J]. Cell Biochem Funct，2011，29（2）：87-95.

[12] Borska S，Chmielewska M，Wysocka T，et al. In vitro effect of quercetin on human gastric carcinoma：Targeting cancer cells death and MDR [J]. Food Chem Toxicol，2012，50（9）：3375-3383.

[13] 蘇維詞.槲皮素的癌化學預防作用研究進展[J].中草藥，2001，32（4）：380-381.

[14] 張軍.桑葉有效成分提取與分析[D].合肥：安徽農業大學，2004.

[15] 陳叢瑾，黃克瀛，李德良，等.植物中黃酮類化合物的提取方法研究概況[J].生物質化學工程，2007，41（3）：42-46.

[16] 馬嵋，張燕，張玲，等.人胃癌細胞株裸鼠皮下移植瘤模型的建立及其生物學特性[J].中國實驗動物學報，2012，20（6）：57-60.

（收稿日期：2014-05-21 本文編輯：衛 軻）

1.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS 17.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。其中細胞增殖的抑制率（%）=1-實驗組/對照組×100%。

2 結果

3 討論

正常環境下，血管生成是一個高度有序的過程，只有生長組織有所需求時，才會誘導單層靜態內皮細胞分化及血管網絡伸展。而腫瘤細胞可以通過模擬正常血管生成過程形成自身血供。腫瘤血管生成主要是通過分泌促血管生長因子，誘導內皮細胞異常增殖、遷移和形成管腔[16]。

桑葉液具有抑制內皮細胞系增殖的能力，抑制作用隨著濃度的增長而增強。通過觀察Transwell小室，與對照組相比添加了桑葉液的內皮細胞系，其遷移能力受到一定的制約作用。Matrigel實驗中，與未加入桑葉液的內皮細胞系所形成的較完整的環狀結構相比，加入桑葉液的內皮細胞系在管腔形成方面受到明顯的抑制作用。實驗表明，桑葉液通過抑制血管內皮細胞增殖、遷移和管腔形成，對腫瘤血管的生成具有抑制作用，從而為其制約腫瘤血管生成、切斷營養與氧氣供給和廢棄物排泄通道、促使腫瘤細胞凋亡提供有力佐證。本研究為桑葉在腫瘤早期預防和治療中的應用提供了實驗依據，使腫瘤早期防治和低成本治療成為可能。

關于本研究只進行了大量的定性實驗，得出桑葉具有抑制血管生成的功效，具體程度尚不明確，且桑葉中的有效組分未知，在之后的研究中將就以上兩個方面進一步給予探討。

[參考文獻]

[1] Folkman J. Tumor angiogenesis： therapeutic implications [J]. The New England Journal of Medicine，1971，285（21）：1182-1186.

[2] Kerbel RS. Tumor angiogenesis：past， present and the near future [J]. Carconogenesis，2000，（21）：505.

[3] 徐韜，許瑞安.中藥及其有效成分抗腫瘤作用機制研究進展[J].華僑大學學報，2009，30，（4）：359-365.

[4] 張舉，肖更生，聊森泰，等.桑葉綜合利用進展[J].廣東蠶業，2003，4（1）：38-41.

[5] 王芳，勵建榮.桑葉的化學成分、生理功能及應用研究進展[J].食品科學，2005，26（1）：111-116.

[6] 歐陽臻，陳鈞.桑葉的化學成分及其藥理作用研究進展[J].江蘇大學學報：自然科學版，2003，24（6）：39-43.

[7] 何雪梅，廖森泰，劉吉平.桑葉的營養功能性成分及藥理作用研究進展[J].蠶業科學，2004，30（4）：390-393.

[8] 張春麗.中藥對腫瘤血管生成抑制作用的研究[J].北京中醫藥，2011，30（2）：156-160.

[9] Wachter J，Neureiter D，Alinger B，et al. Influence of five potential anticancer drugs on wnt pathway and cell survival in human biliary tract cancer cells [J]. Int J Bid Sci，2012，8（1）：15-29.

[10] Qin Y，He LY，Chen Y，et al. Quercetin affects leptin and its receptor in human gastric cancer MGC-803 cells and JAKSTAT pathway [J]. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi，2012，28（1）：12-16.

[11] Senthilkumar K，Arunkumar R，Elumalai P，et al. Quercetin inhibits invasion，migration and signalling molecules involved in cell survival and proliferation of prostate cancer cell line （PC-3） [J]. Cell Biochem Funct，2011，29（2）：87-95.

[12] Borska S，Chmielewska M，Wysocka T，et al. In vitro effect of quercetin on human gastric carcinoma：Targeting cancer cells death and MDR [J]. Food Chem Toxicol，2012，50（9）：3375-3383.

[13] 蘇維詞.槲皮素的癌化學預防作用研究進展[J].中草藥，2001，32（4）：380-381.

[14] 張軍.桑葉有效成分提取與分析[D].合肥：安徽農業大學，2004.

[15] 陳叢瑾，黃克瀛，李德良，等.植物中黃酮類化合物的提取方法研究概況[J].生物質化學工程，2007，41（3）：42-46.

[16] 馬嵋，張燕，張玲，等.人胃癌細胞株裸鼠皮下移植瘤模型的建立及其生物學特性[J].中國實驗動物學報，2012，20（6）：57-60.

（收稿日期：2014-05-21 本文編輯：衛 軻）

1.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS 17.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。其中細胞增殖的抑制率（%）=1-實驗組/對照組×100%。

2 結果

3 討論

正常環境下，血管生成是一個高度有序的過程，只有生長組織有所需求時，才會誘導單層靜態內皮細胞分化及血管網絡伸展。而腫瘤細胞可以通過模擬正常血管生成過程形成自身血供。腫瘤血管生成主要是通過分泌促血管生長因子，誘導內皮細胞異常增殖、遷移和形成管腔[16]。

桑葉液具有抑制內皮細胞系增殖的能力，抑制作用隨著濃度的增長而增強。通過觀察Transwell小室，與對照組相比添加了桑葉液的內皮細胞系，其遷移能力受到一定的制約作用。Matrigel實驗中，與未加入桑葉液的內皮細胞系所形成的較完整的環狀結構相比，加入桑葉液的內皮細胞系在管腔形成方面受到明顯的抑制作用。實驗表明，桑葉液通過抑制血管內皮細胞增殖、遷移和管腔形成，對腫瘤血管的生成具有抑制作用，從而為其制約腫瘤血管生成、切斷營養與氧氣供給和廢棄物排泄通道、促使腫瘤細胞凋亡提供有力佐證。本研究為桑葉在腫瘤早期預防和治療中的應用提供了實驗依據，使腫瘤早期防治和低成本治療成為可能。

關于本研究只進行了大量的定性實驗，得出桑葉具有抑制血管生成的功效，具體程度尚不明確，且桑葉中的有效組分未知，在之后的研究中將就以上兩個方面進一步給予探討。

[參考文獻]

[1] Folkman J. Tumor angiogenesis： therapeutic implications [J]. The New England Journal of Medicine，1971，285（21）：1182-1186.

[2] Kerbel RS. Tumor angiogenesis：past， present and the near future [J]. Carconogenesis，2000，（21）：505.

[3] 徐韜，許瑞安.中藥及其有效成分抗腫瘤作用機制研究進展[J].華僑大學學報，2009，30，（4）：359-365.

[4] 張舉，肖更生，聊森泰，等.桑葉綜合利用進展[J].廣東蠶業，2003，4（1）：38-41.

[5] 王芳，勵建榮.桑葉的化學成分、生理功能及應用研究進展[J].食品科學，2005，26（1）：111-116.

[6] 歐陽臻，陳鈞.桑葉的化學成分及其藥理作用研究進展[J].江蘇大學學報：自然科學版，2003，24（6）：39-43.

[7] 何雪梅，廖森泰，劉吉平.桑葉的營養功能性成分及藥理作用研究進展[J].蠶業科學，2004，30（4）：390-393.

[8] 張春麗.中藥對腫瘤血管生成抑制作用的研究[J].北京中醫藥，2011，30（2）：156-160.

[9] Wachter J，Neureiter D，Alinger B，et al. Influence of five potential anticancer drugs on wnt pathway and cell survival in human biliary tract cancer cells [J]. Int J Bid Sci，2012，8（1）：15-29.

[10] Qin Y，He LY，Chen Y，et al. Quercetin affects leptin and its receptor in human gastric cancer MGC-803 cells and JAKSTAT pathway [J]. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi，2012，28（1）：12-16.

[11] Senthilkumar K，Arunkumar R，Elumalai P，et al. Quercetin inhibits invasion，migration and signalling molecules involved in cell survival and proliferation of prostate cancer cell line （PC-3） [J]. Cell Biochem Funct，2011，29（2）：87-95.

[12] Borska S，Chmielewska M，Wysocka T，et al. In vitro effect of quercetin on human gastric carcinoma：Targeting cancer cells death and MDR [J]. Food Chem Toxicol，2012，50（9）：3375-3383.

[13] 蘇維詞.槲皮素的癌化學預防作用研究進展[J].中草藥，2001，32（4）：380-381.

[14] 張軍.桑葉有效成分提取與分析[D].合肥：安徽農業大學，2004.

[15] 陳叢瑾，黃克瀛，李德良，等.植物中黃酮類化合物的提取方法研究概況[J].生物質化學工程，2007，41（3）：42-46.

[16] 馬嵋，張燕，張玲，等.人胃癌細胞株裸鼠皮下移植瘤模型的建立及其生物學特性[J].中國實驗動物學報，2012，20（6）：57-60.

（收稿日期：2014-05-21 本文編輯：衛 軻）