PI—103對人黑色素瘤A375細胞遷移和侵襲能力的影響及其機制研究

陸茂等

[摘要] 目的 觀察PI-103在體外對人黑色素瘤A375細胞遷移和侵襲能力的影響，并探討可能的作用機制。 方法 應用MTT法檢測不同濃度PI-103對A375細胞增殖的影響，Transwell小室實驗檢測0.1、0.2 μmol/L PI-103對A375細胞遷移能力和侵襲能力的影響，Western Blot法測定細胞基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9的表達。 結果 0.1、0.2 μmol/L PI-103對A375細胞增殖的抑制作用不明顯（P > 0.05）；在濃度高于0.4 μmol/L時，PI-103能夠明顯抑制A375細胞的增殖（P < 0.05）。0.1 μmol/L PI-103作用后，遷移實驗和運動實驗穿膜細胞數分別為（91.73±13.80）、（63.67±8.54），與對照組比較明顯減少，差異有統計學意義（P < 0.05）；0.2 μmol/L PI-103作用后，遷移實驗和運動實驗穿膜細胞數分別為（64.07±9.22）、（34.80±7.89），與對照組比較明顯減少，差異有統計學意義（P < 0.05）。0.1、0.2 μmol/L PI-103作用后，A375細胞MMP-2、MMP-9蛋白表達明顯低于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 PI-103可通過下調MMP-2、MMP-9的表達抑制A375細胞遷移和侵襲，為其應用于抗惡性黑素瘤轉移治療提供了實驗依據。

[關鍵詞] PI-103；黑色素瘤；遷移；侵襲

[中圖分類號] R739.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）09（a）-0014-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of PI-103 on the migratory and invasive abilities of human melanoma A375 cells in vitro and its mechanism. Methods The effects of PI-103 with different concentration on the proliferation of A375 cells were detected by MTT assay. The effects of PI-103 at 0.1， 0.2 μmol/L concentration on the migratory and invasive abilities of A375 cells were detected by transwell chamber assay. The expressions of MMP-2 and MMP-9 in A375 cells were determined by Western Blot. Results The inhibition effects on the proliferation of A375 cells treated with PI-103 at 0.1， 0.2 μmol/L concentration were not significant （P > 0.05）. The proliferation of A375 cells treated with PI-103 at the concentration higher than 0.4 μmol/L was significantly inhibited （P < 0.05）. The numbers of transmembrane cells in the migration and invasion experiment treated with PI-103 at 0.1 μmol/L concentration were （91.73±13.80）， （63.67±8.54） respectively， which were significantly decreased compared with control group （P < 0.05）. The numbers of transmembrane cells in the migration and invasion experiment treated with PI-103 at 0.2 μmol/L concentration were （64.07±9.22）， （34.80±7.89） respectively， which were significantly decreased compared with control group （P < 0.05）. The expressions of MMP-2 and MMP-9 in A375 cells treated with PI-103 at 0.1， 0.2 μmol/L concentration were significantly decreased compared with control group （P < 0.05）. Conclusion PI-103 can inhibit the migration and invasion of A375 cells by down-regulation of the expressions of MMP-2 and MMP-9， which provide the experimental basis for the prevention of melanoma metastasis.

[Key words] PI-103； Melanoma； Migration； Invasion

惡性黑素瘤是一種起源于黑色素細胞的高度惡性腫瘤，易轉移是其死亡率高的主要原因。黑色素瘤細胞的侵襲轉移與信號轉導通路的異常激活密切相關，在有關信號轉導通路抑制劑中，篩選出高效、低毒的抗黑色素瘤細胞轉移藥物已成為其研究重要的發展趨勢。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與其上游的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（PKB，又稱Akt）構成了PI3K/Akt/mTOR信號轉導通路。筆者前期及既往其他研究結果顯示，PI3K/Akt/mTOR信號通路與黑素細胞的增殖和轉移密切相關[1-2]。PI-103是PI3K和mTOR的雙重抑制劑，已有研究報道，PI-103在較低濃度下就能導致黑色素瘤細胞周期阻滯，從而抑制其增殖并誘導凋亡[3]，但有關PI-103對黑色素瘤細胞遷移和侵襲的影響國內外鮮見報道。本研究旨在觀察PI-103在體外對人黑色素瘤A375細胞遷移和侵襲能力的影響，并探討可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

PI-103（純度99.59%）購自美國MCE公司；人黑色素瘤A375細胞購自中國科學院上海細胞生物研究所；RPMI1640培養液購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自美國Sigma公司；胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司；Millicell懸掛式Transwell小室（孔徑8 μm）購自美國Millipore公司；Matrigel購自美國BD公司；鼠抗人基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinases-2，MMP-2）、MMP-9單抗、堿性磷酸酶標記羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將A375細胞置于37℃、5%CO2的孵箱中常規培養，培養液為含10%FBS的RPMI1640。每隔48 h換液1次，以1∶3的比例傳代。

1.2.2 MTT法檢測PI-103對A375細胞增殖的影響 取對數生長期A375細胞，調整細胞密度為1×105/mL，接種于48孔板，200 μL/孔。培養24 h后吸除培養液，每孔分別加入200 μL不同濃度的PI-103（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol/L），每組設5個復孔，同時設空白對照組，對照組加入等量不含PI-103的培養液。24 h后加入20 μL MTT（5 mg/mL），37℃作用4 h后加150 μL DMSO，振蕩10 min，酶標儀測490 nm處吸光度（OD）值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=（1-實驗組OD/對照組OD）×100%。

1.2.3 Transwell遷移實驗檢測PI-103對A375細胞遷移力的影響 取對數生長期A375細胞以1×105/mL細胞懸液接種于24孔板，24 h后加入不同濃度的PI-103（終濃度0.1、0.2 μmol/L），設空白對照組，對照組加入等量不含PI-103的培養液，48 h后收集細胞。各組細胞消化、離心后用無血清RPMI1640培養液重懸，調整細胞密度至1×106/mL。將Transwell小室置入24孔板，上室加入200 μL無血清RPMI1640培養液，37℃放置1 h，吸除小室內培養液，上室加入200 μL各組細胞重懸液，下室加500 μL含10%FBS的RPMI1640培養液，37℃、5%CO2孵育24 h后取出小室，棉簽擦去濾膜上層細胞，PBS清洗濾膜，4%的多聚甲醛固定15 min，0.1%結晶紫染色15 min。400倍顯微鏡下隨機計數不重疊5個視野的穿膜細胞數，計算平均值。實驗重復3次，每組設3個復孔。

1.2.4 Transwell侵襲實驗檢測PI-103對A375細胞侵襲力的影響 4℃溶解Matrigel過夜，用預冷的無血清培養液以1∶8稀釋Matrigel，取50 μL均勻涂于Transwell小室上室的聚碳酸酯膜上，37℃放置30 min，使Matrigel聚合成凝膠，后續同遷移實驗。細胞接種密度為2×105/mL。

1.2.5 Western Blot法測定PI-103對A375細胞MMP-2、MMP-9表達的影響 同“1.2.3”項下操作收集細胞，加入細胞裂解液，離心提取蛋白質定量，進行SDS-PAGE電泳分離，電轉至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉，加入鼠抗人MMP-2、MMP-9單抗作一抗，4℃過夜，TBST洗膜，用堿性磷酸酶標記羊抗鼠IgG作為二抗，37℃孵育2 h，TBST洗膜，加入ECL進行曝光，洗片后用圖像分析系統進行吸光度掃描，以GAPDH作為內參，用各蛋白吸光度值/內參吸光度值進行比較。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

3 討論

PI3K/Akt/mTOR信號通路在多種惡性腫瘤中高度激活，調控腫瘤細胞增殖、生長、轉移等過程，已成為腫瘤治療的一個重要靶點[4]。有研究表明，單純阻斷PI3K/Akt通路，并不能有效抑制下游mTOR通路，因為mTOR信號通路的激活除了來自PI3K/Akt途徑，還可來自其他信號通路，而單純抑制mTOR通路，卻可能通過負反饋活化PI3K激酶。所以，同時使用PI3K和mTOR的雙重抑制劑更能有效抑制腫瘤的生長和轉移[5]。PI-103是人工合成的脂質激酶家族中的一種小分子藥物，能同時抑制PI3K和mTOR，尤其是PI3Kα、mTORC1和mTORC2，而且PI-103有良好的藥物穩定性，毒副作用小[6-7]。已有研究發現，PI-103可抑制結直腸癌細胞[7]、乳腺癌細胞[8]、神經母細胞瘤細胞[9]、肝星狀細胞細胞[10]、腎癌細胞[11]的增殖，還可抑制結直腸癌細胞[12]、神經膠質瘤細胞[13]的轉移，同時可增強順鉑[6]、厄洛替尼[14]等化療藥物抗腫瘤效果。

Transwell小室能夠較為理想地模擬和反映腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，是檢測腫瘤細胞體外遷移力和侵襲力最經典的實驗方法。本實驗旨在研究PI-103對A375細胞遷移和侵襲的影響，若出現細胞活力下降則影響結果的判斷，因此本研究選擇了PI-103對A375細胞活力影響小的濃度（低于0.4 μmol/L）來進行Transwell體外遷移和侵襲實驗。結果顯示，經0.1、0.2 μmol/L PI-103作用后穿過小室的A375細胞數量減少，提示PI-103可以降低A375細胞的遷移力和侵襲力。

腫瘤細胞的遷移和侵襲是一個多步驟、多階段的復雜過程，細胞基底膜及細胞外基質的降解突破是其中重要的環節之一。MMPs是基底膜及細胞外基質降解的主要蛋白水解酶，其中MMP-2、MMP-9是MMPs家族中的重要成員，能有效降解基底膜的主要成分Ⅳ型膠原和層粘連蛋白，其表達水平與腫瘤細胞的侵襲轉移密切相關[15]。有研究表明，PI3K可通過活化Akt激活黑色素瘤細胞磷脂蛋白2，進而促進MMP-2的表達[16]。大量研究證實，黑色素瘤細胞MMP-2、MMP-9的表達水平與其侵襲力呈正相關，抑制MMP-2、MMP-9的表達能抑制黑素瘤細胞的侵襲和轉移[17-18]。本研究顯示，PI-103在體外可抑制A375細胞MMP-2、MMP-9的表達，由此推測PI-103可能是通過競爭性抑制黑色素瘤細胞PI3K/mTOR，阻斷Pl3K/Akt/mTOR信號通路，下調MMP-2、MMP-9的表達，進而抑制其遷移和侵襲。

綜上所述，PI3K/mTOR雙重抑制劑PI-103在體外可抑制A375細胞遷移和侵襲，其機制可能與下調MMP-2、MMP-9的表達有關，這顯示了它在惡性黑素瘤治療中的潛在應用價值，為其應用于抗惡性黑素瘤轉移治療提供了初步的實驗依據。

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（收稿日期：2014-05-23 本文編輯：程 銘）

綜上所述，PI3K/mTOR雙重抑制劑PI-103在體外可抑制A375細胞遷移和侵襲，其機制可能與下調MMP-2、MMP-9的表達有關，這顯示了它在惡性黑素瘤治療中的潛在應用價值，為其應用于抗惡性黑素瘤轉移治療提供了初步的實驗依據。

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（收稿日期：2014-05-23 本文編輯：程 銘）

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（收稿日期：2014-05-23 本文編輯：程 銘）