PI-103對人黑色素瘤A375細胞遷移和侵襲能力的影響及其機制研究

陸茂 葉俊儒 彭科 宋黎

成都醫學院第一附屬醫院皮膚科，四川成都610500

PI-103對人黑色素瘤A375細胞遷移和侵襲能力的影響及其機制研究

陸茂 葉俊儒 彭科 宋黎

成都醫學院第一附屬醫院皮膚科，四川成都610500

目的觀察PI-103在體外對人黑色素瘤A375細胞遷移和侵襲能力的影響，并探討可能的作用機制。方法應用MTT法檢測不同濃度PI-103對A375細胞增殖的影響，Transwell小室實驗檢測0.1、0.2 μmol/L PI-103對A375細胞遷移能力和侵襲能力的影響，Western Blot法測定細胞基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9的表達。結果0.1、0.2 μmol/L PI-103對A375細胞增殖的抑制作用不明顯（P＞0.05）；在濃度高于0.4 μmol/L時，PI-103能夠明顯抑制A375細胞的增殖（P＜0.05）。0.1 μmol/L PI-103作用后，遷移實驗和運動實驗穿膜細胞數分別為（91.73±13.80）、（63.67±8.54），與對照組比較明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05）；0.2 μmol/L PI-103作用后，遷移實驗和運動實驗穿膜細胞數分別為（64.07±9.22）、（34.80±7.89），與對照組比較明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。0.1、0.2 μmol/L PI-103作用后，A375細胞MMP-2、MMP-9蛋白表達明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論PI-103可通過下調MMP-2、MMP-9的表達抑制A375細胞遷移和侵襲，為其應用于抗惡性黑素瘤轉移治療提供了實驗依據。

PI-103；黑色素瘤；遷移；侵襲

惡性黑素瘤是一種起源于黑色素細胞的高度惡性腫瘤，易轉移是其死亡率高的主要原因。黑色素瘤細胞的侵襲轉移與信號轉導通路的異常激活密切相關，在有關信號轉導通路抑制劑中，篩選出高效、低毒的抗黑色素瘤細胞轉移藥物已成為其研究重要的發展趨勢。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與其上游的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（PKB，又稱Akt）構成了PI3K/Akt/mTOR信號轉導通路。筆者前期及既往其他研究結果顯示，PI3K/Akt/mTOR信號通路與黑素細胞的增殖和轉移密切相關[1-2]。PI-103是PI3K和mTOR的雙重抑制劑，已有研究報道，PI-103在較低濃度下就能導致黑色素瘤細胞周期阻滯，從而抑制其增殖并誘導凋亡[3]，但有關PI-103對黑色素瘤細胞遷移和侵襲的影響國內外鮮見報道。本研究旨在觀察PI-103在體外對人黑色素瘤A375細胞遷移和侵襲能力的影響，并探討可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

PI-103（純度99.59%）購自美國MCE公司；人黑色素瘤A375細胞購自中國科學院上海細胞生物研究所；RPMI1640培養液購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自美國Sigma公司；胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司；Millicell懸掛式Transwell小室（孔徑8 μm）購自美國Millipore公司；Matrigel購自美國BD公司；鼠抗人基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinases-2，MMP-2）、MMP-9單抗、堿性磷酸酶標記羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養將A375細胞置于37℃、5%CO2的孵箱中常規培養，培養液為含10%FBS的RPMI1640。每隔48 h換液1次，以1∶3的比例傳代。

1.2.2 MTT法檢測PI-103對A375細胞增殖的影響取對數生長期A375細胞，調整細胞密度為1×105/mL，接種于48孔板，200 μL/孔。培養24 h后吸除培養液，每孔分別加入200 μL不同濃度的PI-103（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol/L），每組設5個復孔，同時設空白對照組，對照組加入等量不含PI-103的培養液。24 h后加入20 μL MTT（5 mg/mL），37℃作用4 h后加150 μL DMSO，振蕩10 min，酶標儀測490 nm處吸光度（OD）值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=（1-實驗組OD/對照組OD）×100%。

1.2.3 Transwell遷移實驗檢測PI-103對A375細胞遷移力的影響取對數生長期A375細胞以1× 105/mL細胞懸液接種于24孔板，24 h后加入不同濃度的PI-103（終濃度0.1、0.2 μmol/L），設空白對照組，對照組加入等量不含PI-103的培養液，48 h后收集細胞。各組細胞消化、離心后用無血清RPMI1640培養液重懸，調整細胞密度至1×106/mL。將Transwell小室置入24孔板，上室加入200 μL無血清RPMI1640培養液，37℃放置1 h，吸除小室內培養液，上室加入200 μL各組細胞重懸液，下室加500 μL含10%FBS的RPMI1640培養液，37℃、5%CO2孵育24 h后取出小室，棉簽擦去濾膜上層細胞，PBS清洗濾膜，4%的多聚甲醛固定15 min，0.1%結晶紫染色15 min。400倍顯微鏡下隨機計數不重疊5個視野的穿膜細胞數，計算平均值。實驗重復3次，每組設3個復孔。

1.2.4 Transwell侵襲實驗檢測PI-103對A375細胞侵襲力的影響4℃溶解Matrigel過夜，用預冷的無血清培養液以1∶8稀釋Matrigel，取50 μL均勻涂于Transwell小室上室的聚碳酸酯膜上，37℃放置30 min，使Matrigel聚合成凝膠，后續同遷移實驗。細胞接種密度為2×105/mL。

1.2.5 Western Blot法測定PI-103對A375細胞MMP-2、MMP-9表達的影響同“1.2.3”項下操作收集細胞，加入細胞裂解液，離心提取蛋白質定量，進行SDS-PAGE電泳分離，電轉至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉，加入鼠抗人MMP-2、MMP-9單抗作一抗，4℃過夜，TBST洗膜，用堿性磷酸酶標記羊抗鼠IgG作為二抗，37℃孵育2 h，TBST洗膜，加入ECL進行曝光，洗片后用圖像分析系統進行吸光度掃描，以GAPDH作為內參，用各蛋白吸光度值/內參吸光度值進行比較。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PI-103對A375細胞增殖的影響

0.1、0.2 μmol/L PI-103對A375細胞增殖的抑制作用不明顯，與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；在濃度高于0.4 μmol/L時，PI-103能夠明顯抑制A375細胞的增殖，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。為了排除PI-103抑制A375細胞增殖作用對遷移和侵襲的影響，本研究選擇低于0.4 μmol/L的濃度進行后續實驗。

2.2 PI-103對A375細胞遷移力和侵襲力的影響

0.1、0.2 μmol/L PI-103作用后，與對照組比較，Transwell遷移實驗和侵襲實驗穿膜細胞數均明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表1 PI-103對A375細胞增殖的影響（x±s）

表2 PI-103對A375細胞遷移力和侵襲力的影響（x±s）

2.3 PI-103對A375細胞MMP-2、MMP-9表達的影響

與對照組比較，0.1、0.2 μmol/L PI-103作用后，A375細胞中MMP-2、MMP-9表達均明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1、表3。

圖1 PI-103作用后A375細胞中MMP-2、MMP-9表達情況

表3PI-103對A375細胞MMP-2、MMP-9表達的影響（%，x±s）

3 討論

PI3K/Akt/mTOR信號通路在多種惡性腫瘤中高度激活，調控腫瘤細胞增殖、生長、轉移等過程，已成為腫瘤治療的一個重要靶點[4]。有研究表明，單純阻斷PI3K/Akt通路，并不能有效抑制下游mTOR通路，因為mTOR信號通路的激活除了來自PI3K/Akt途徑，還可來自其他信號通路，而單純抑制mTOR通路，卻可能通過負反饋活化PI3K激酶。所以，同時使用PI3K和mTOR的雙重抑制劑更能有效抑制腫瘤的生長和轉移[5]。PI-103是人工合成的脂質激酶家族中的一種小分子藥物，能同時抑制PI3K和mTOR，尤其是PI3Kα、mTORC1和mTORC2，而且PI-103有良好的藥物穩定性，毒副作用小[6-7]。已有研究發現，PI-103可抑制結直腸癌細胞[7]、乳腺癌細胞[8]、神經母細胞瘤細胞[9]、肝星狀細胞細胞[10]、腎癌細胞[11]的增殖，還可抑制結直腸癌細胞[12]、神經膠質瘤細胞[13]的轉移，同時可增強順鉑[6]、厄洛替尼[14]等化療藥物抗腫瘤效果。

Transwell小室能夠較為理想地模擬和反映腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，是檢測腫瘤細胞體外遷移力和侵襲力最經典的實驗方法。本實驗旨在研究PI-103對A375細胞遷移和侵襲的影響，若出現細胞活力下降則影響結果的判斷，因此本研究選擇了PI-103對A375細胞活力影響小的濃度（低于0.4 μmol/L）來進行Transwell體外遷移和侵襲實驗。結果顯示，經0.1、0.2 μmol/L PI-103作用后穿過小室的A375細胞數量減少，提示PI-103可以降低A375細胞的遷移力和侵襲力。

腫瘤細胞的遷移和侵襲是一個多步驟、多階段的復雜過程，細胞基底膜及細胞外基質的降解突破是其中重要的環節之一。MMPs是基底膜及細胞外基質降解的主要蛋白水解酶，其中MMP-2、MMP-9是MMPs家族中的重要成員，能有效降解基底膜的主要成分Ⅳ型膠原和層粘連蛋白，其表達水平與腫瘤細胞的侵襲轉移密切相關[15]。有研究表明，PI3K可通過活化Akt激活黑色素瘤細胞磷脂蛋白2，進而促進MMP-2的表達[16]。大量研究證實，黑色素瘤細胞MMP-2、MMP-9的表達水平與其侵襲力呈正相關，抑制MMP-2、MMP-9的表達能抑制黑素瘤細胞的侵襲和轉移[17-18]。本研究顯示，PI-103在體外可抑制A375細胞MMP-2、MMP-9的表達，由此推測PI-103可能是通過競爭性抑制黑色素瘤細胞PI3K/mTOR，阻斷Pl3K/Akt/mTOR信號通路，下調MMP-2、MMP-9的表達，進而抑制其遷移和侵襲。

綜上所述，PI3K/mTOR雙重抑制劑PI-103在體外可抑制A375細胞遷移和侵襲，其機制可能與下調MMP-2、MMP-9的表達有關，這顯示了它在惡性黑素瘤治療中的潛在應用價值，為其應用于抗惡性黑素瘤轉移治療提供了初步的實驗依據。

[1]陸茂，葉俊儒，樊元春，等.磷酸化mTOR在惡性黑素瘤中的表達及與CyclinD1的關系[J].四川醫學，2010，31（2）：163-165.

[2]Uzdensky AB，Demyanenko SV，Bibov MY.Signal transduction in human cutaneous melanoma and target drugs[J].Curr Cancer Drug Targets，2013，13（8）：843-866.

[3]Lopez-Fauqued M，Gil R，Grueso J，et al.The dual PI3K/ mTOR inhibitor PI-103 promotes immunosuppression，in vivo tumor growth and increases survival of sorafenibtreated melanoma cells[J].Int J Cancer，2010，126（7）：1549-1561.

[4]Wu P，Hu YZ.PI3K/Akt/mTOR pathway inhibitors in cancer：a perspective on clinical progress[J].Curr Med Chem，2010，17（35）：4326-4321.

[5]Mazzoletti M，Bortolin F，Brunelli L，et al.Combination of PI3K/mTOR inhibitors：antitumor activity and molecular correlates[J].Cancer Res，2011，71（13）：4573-4584.

[6]劉俊，蔡云朗，任慕蘭，等.PI-103對人卵巢癌細胞株SKOV3/ DDP順鉑化療效果的影響[J].東南大學學報：醫學版，2013，32（5）：574-579.

[7]Saturno G，Valenti M，De Haven Brandon A，et al.Combining trail with PI3 kinase or HSP90 inhibitors enhances apoptosis in colorectal cancer cells via suppression of survival signaling[J].Oncotarget，2013，4（8）：1185-1198.

[8]Yi YW，Hong W，Kang HJ，et al.Inhibition of the PI3K/ AKT pathway potentiates cytotoxicity of EGFR kinase inhibitors in triple-negative breast cancer cells[J].J Cell Mol Med，2013，17（5）：648-656.

[9]Santo EE，Stroeken P，Sluis PV，et al.FOXO3a is a major target of inactivation by PI3K/AKT signaling in aggressive neuroblastoma[J].Cancer Res，2013，73（7）：2189-2198.

[10]李娜，祝聰聰，肖永紅，等.PI3K抑制劑對四氯化碳刺激的肝星狀細胞增殖和Ⅰ型膠原表達的影響[J].西安交通大學學報：醫學版，2013，34（2）：164-167.

[11]邢建武，于碩鵬.抑制劑PI-103對786-O細胞株PI3K/ Akt/mTOR信號通路的影響[J].河南醫學研究，2013，22（5）：649-651.

[12]Hsu RY，Chan CH，Spicer JD，et al.LPS-Induced TLR4 Signaling in Human Colorectal Cancer Cells Increases {beta}1 Integrin-Mediated Cell Adhesion and Liver Metastasis[J].Cancer Res，2011，71（5）：1989-1998.

[13]Bagci-Onder T，Wakimoto H，Anderegg M，et al.A dual PI3K/mTOR inhibitor，PI-103，cooperates with stem cell-delivered TRAIL in experimental glioma models[J]. Cancer Res，2011，71（1）：154-163.

[14]ToulanyM，MinjgeeM，SakiM，etal.ERK2-dependentreactivation of Akt mediates the limited response of tumor cells with constitutive K-RAS activity to PI3K inhibition[J]. Cancer Biol Ther，2014，15（3）：317-328.

[15]Zhang XX，Fu Z，Zhang Z，et al.Miemeystin-LR promotes melanoma cell invasion and enhances matrix metallopmteinase-2/-9 expression mediated by NF-KB activation[J].Environ Sci Technol，2012，46（20）：11319-11326.

[16]Sonoda Y，Warita M，Suzuki T，et al.Proteolipid protein 2 is associated with melanoma metastasis[J].Oncol Rep，2010，23（2）：371-376.

[17]Shi H，Liu L，Liu L，et al.β-Elemene inhibits the metastasis of B16F10 melanoma cells by downregulation of the expression of uPA，uPAR，MMP-2，and MMP-9[J].Mela noma Res，2014，24（2）：99-107.

[18]ReyMC，BonamigoRR，CartellA，etal.MMP-2andTIMP-2 in cutaneous melanoma：association with prognostic factors and description in cutaneous metastases[J].Am J Dermatopathol，2011，33（4）：413-414.

Effects of PI-103 on migratory and invasive abilities of human melanoma A375 cells and its mechanism

LU MaoYE JunruPENG KeSONG Li
Department of Dermatology,the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College,Sichuan Province,Chengdu 610500,China

Objective To investigate the effects of PI-103 on the migratory and invasive abilities of human melanoma A375 cells in vitro and its mechanism.Methods The effects of PI-103 with different concentration on the proliferation of A375 cells were detected by MTT assay.The effects of PI-103 at 0.1,0.2 μmol/L concentration on the migratory and invasive abilities of A375 cells were detected by transwell chamber assay.The expressions of MMP-2 and MMP-9 in A375 cells were determined by Western Blot.Results The inhibition effects on the proliferation of A375 cells treated with PI-103 at 0.1,0.2 μmol/L concentration were not significant(P＞0.05).The proliferation of A375 cells treated with PI-103 at the concentration higher than 0.4 μmol/L was significantly inhibited(P＜0.05).The numbers of transmembrane cells in the migration and invasion experiment treated with PI-103 at 0.1 μmol/L concentration were (91.73±13.80),(63.67±8.54)respectively,which were significantly decreased compared with control group(P＜0.05). The numbers of transmembrane cells in the migration and invasion experiment treated with PI-103 at 0.2 μmol/L concentration were(64.07±9.22),(34.80±7.89)respectively,which were significantly decreased compared with control group(P＜0.05).The expressions of MMP-2 and MMP-9 in A375 cells treated with PI-103 at 0.1,0.2 μmol/L concentration were significantly decreased compared with control group(P＜0.05).Conclusion PI-103 can inhibit the migration and invasion of A375 cells by down-regulation of the expressions of MMP-2 and MMP-9,which provide the experimental basis for the prevention of melanoma metastasis.

PI-103;Melanoma;Migration;Invasion

R739.5

A

1673-7210（2014）09（a）-0014-04

2014-05-23本文編輯：程銘）

四川省衛生廳立項科研課題（編號110466）。

陸茂（1975-），男，碩士，副主任醫師；研究方向：皮膚組織病理學。