高效液相色譜法測(cè)定六葉龍膽不同部位的龍膽苦苷含量

孫曉 郭耀武 楊瑞瑞

1.陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽(yáng)712046；2.陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，陜西西安710065

高效液相色譜法測(cè)定六葉龍膽不同部位的龍膽苦苷含量

孫曉1郭耀武2楊瑞瑞2

1.陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽(yáng)712046；2.陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，陜西西安710065

目的采用高效液相色譜法測(cè)定六葉龍膽不同部位的龍膽苦苷含量，比較不同部位龍膽苦苷的含量。方法CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相為甲醇-0.5%乙酸水溶液（25∶75）；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為32℃。結(jié)果龍膽苦苷在0.5～6.9 μg范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為Y=1.2908×106X+ 4.8047×104，相關(guān)系數(shù)（r）=0.9999，測(cè)定方法的平均回收率為98.56%，RSD=1.01%（n=6）。龍膽苦苷含量測(cè)量結(jié)果為：花＞根＞莖＞葉＞枯龍膽。結(jié)論本研究所采用的高效液相色譜法快速簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，精密度好；六葉龍膽不同部位中龍膽苦苷含量有較大差異。

高效液相色譜法；六葉龍膽；不同部位；龍膽苦苷

龍膽科龍膽屬植物全世界約有400余種，我國(guó)有240余種，分布遍及全國(guó)[1]。六葉龍膽（Gentiana hexaphylla Maxim.ex Kusnez.）為龍膽科龍膽屬的多年生草本植物。六葉龍膽出自《青藏藥鑒》，書(shū)中記載藏藥名稱(chēng)為吉解那保。主要分布在中國(guó)內(nèi)地的甘肅、西藏、青海、四川、陜西秦嶺等高海拔地區(qū)，主要生長(zhǎng)在海拔2500～3500 m的山坡草地、路旁、高山草甸及灌叢中[2]，是秦嶺北坡關(guān)中中部的習(xí)用草藥之一，目前尚未由人工引種栽培，蘊(yùn)藏量較大。

已有文獻(xiàn)報(bào)道稱(chēng)龍膽科植物的主要活性成分為環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化合物，包括龍膽苦苷、馬錢(qián)酸、獐牙菜苦苷及獐芽菜苷等[3]。其中具有強(qiáng)烈苦味活性的龍膽苦苷是其主要有效成分之一，是龍膽藥苦寒的物質(zhì)基礎(chǔ)[4]，具有保肝、利膽、抗炎、抗過(guò)敏、健胃等多種藥理作用，是評(píng)價(jià)龍膽藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)[5-6]。

近年來(lái)龍膽商品藥材使用量加大，但由于長(zhǎng)期無(wú)序采挖導(dǎo)致野生資源銳減，部分地區(qū)資源枯竭[7]。為擴(kuò)大藥用資源，本文對(duì)六葉龍膽不同部位的主要化學(xué)成分龍膽苦苷含量做了比較，對(duì)今后合理開(kāi)發(fā)利用這一藥用植物資源提供指導(dǎo)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AD型液相色譜儀；色譜柱；CAPCELL PAK C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；電子分析德國(guó)賽多利斯Sartorius BP系列天平；KQ500DE臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器；大德藥機(jī)搖擺式離心機(jī)。

1.2 材料與試藥

本文所采用實(shí)驗(yàn)材料六葉龍膽均采自秦嶺，采挖時(shí)間為7～9月份，經(jīng)陜西省食品藥品檢驗(yàn)所郭耀武主任藥師鑒定為龍膽科植物六葉龍膽（Gentiana hexaphylla Maxim.ex Kusnez.），其中編號(hào)1的樣品采自戶(hù)縣光頭山，編號(hào)2的樣品采自周至縣厚畛子，編號(hào)3的樣品采自長(zhǎng)安縣終南山。

龍膽苦苷對(duì)照品（供含量測(cè)定用，含量以96.9%計(jì)，批號(hào)為110770-201013）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用試劑均為國(guó)藥“滬試”牌分析純，流動(dòng)相為色譜純，微孔濾膜統(tǒng)一為0.45 μm有機(jī)系尼龍微孔濾膜，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：CAPCELLPAKC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.5%乙酸水溶液（25∶75）；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；流速：1.0 mL/min[8]；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫32℃。理論塔板數(shù)以龍膽苦苷計(jì)算應(yīng)不低于4500。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取龍膽苦苷對(duì)照品10 mg，置25 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的溶液，用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，作為對(duì)照品溶液，備用[9]。

2.2.2 供試品溶液的制備分取六葉龍膽干燥根、莖、葉、花、全草、枯六葉龍膽等六部分，分別放于旋轉(zhuǎn)式離心機(jī)中粉碎。精密稱(chēng)取各部位粉末各0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，稱(chēng)定并記錄重量[10]。考慮到龍膽苦苷自身的不穩(wěn)定性會(huì)導(dǎo)致分解從而提取率下降，故超聲處理分為兩階段[11]。第一階段超聲頻率設(shè)置為500 W，超聲時(shí)間設(shè)置為15 min，取出自然冷卻至室溫，第二階段再次超聲15 min，頻率設(shè)置依舊為500 W。超聲結(jié)束后取出冷卻至室溫后稱(chēng)定重量，對(duì)比超聲前重量記錄，用甲醇補(bǔ)定減失重量。振搖后靜置取上清液，用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液[12-13]。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

按上述色譜條件，將制備好的對(duì)照品溶液、供試品溶液，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，結(jié)果供試品溶液在與對(duì)照品溶液相同保留時(shí)間處有一致的色譜峰，且吸收峰達(dá)到基線(xiàn)分離，分離度均大于1.6，理論塔板數(shù)均大于4500，說(shuō)明上述色譜條件適用于六葉龍膽中龍膽苦苷含量測(cè)定。見(jiàn)圖1。

圖1 龍膽苦苷的高效液相色譜圖

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

分別精密吸取對(duì)照品溶液2、5、10、15、20、25 μL，按上述色譜條件依次進(jìn)樣，以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算得回歸方程Y=1.2908× 106X+4.8047×104，相關(guān)系數(shù)（r）=0.9999，計(jì)算結(jié)果表明龍膽苦苷在0.5~6.9 μg之間線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取龍膽苦苷對(duì)照品溶液10 μL，在上述色譜條件下連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄每次峰面積，計(jì)算得RSD為1.10%，表明本實(shí)驗(yàn)方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取按上述制備條件制備的對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別精密吸取10 μL，在18 h內(nèi)各進(jìn)樣5次，各自記錄峰面積，計(jì)算得到對(duì)照品溶液的RSD值為0.55%（n=5），結(jié)果表明對(duì)照品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；供試品溶液的RSD值為0.98%（n=5），表明供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同批六葉龍膽樣品按上述方法平行制備6份供試品溶液，按上述色譜測(cè)定條件方法，測(cè)定，記錄各自峰面積，計(jì)算RSD為1.10%（n=6），結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的六葉龍膽全草樣品6份，分別精密加入龍膽苦苷對(duì)照品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。測(cè)定并計(jì)算其各自的回收率，然后計(jì)算得到平均回收率為98.56%，RSD為1.01%（n=6），結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)方法可行。見(jiàn)表1。

表1 龍膽苦苷回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.9 樣品含量測(cè)定

分別取六葉龍膽根，莖，葉，花，全草，枯龍膽干燥粉末，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各平行制備2份，每份精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行含量測(cè)定。見(jiàn)表2。

表2 含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 龍膽苦苷含量測(cè)定

《中國(guó)藥典》2010年版龍膽項(xiàng)下規(guī)定的龍膽苦苷含量限度龍膽不少于3.0%，堅(jiān)龍膽不少于1.5%[14-16]。本文六葉龍膽測(cè)定結(jié)果根含量為1.74%，花含量為2.91%，全草含量1.02%，表明六葉龍膽確有一定的應(yīng)用價(jià)值。

3.2 提取條件研究

3.2.1 提取時(shí)間的考察按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，對(duì)六葉龍膽提取時(shí)間進(jìn)行考察，分為15、30、45、60 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著超聲波提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率在30 min前呈上升趨勢(shì)，30 min后趨于平緩。

3.2.2 料液比的考察按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，設(shè)定料液比為1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著提取溶劑比例的不斷加大，提取率呈上升趨勢(shì)，并在料液比1∶50后趨于平緩。

3.2.3 提取條件的確定比較靜態(tài)熱回流提取法、動(dòng)態(tài)熱回流提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法等方法各自的提取率。綜合溫度因素對(duì)龍膽苦苷穩(wěn)定性的影響，考慮到龍膽苦苷自身的對(duì)熱不穩(wěn)定性，可能會(huì)導(dǎo)致龍膽苦苷分解從而使提取率下降。最終確定提取條件為：料液比1∶50、超聲處理兩階段。第一階段超聲頻率設(shè)置為500 W，超聲時(shí)間設(shè)置為15 min，取出自然冷卻至室溫，第二階段再次超聲15 min，頻率依舊設(shè)置為500 W。

3.3 六葉龍膽采收時(shí)間

六葉龍膽根部相比《中國(guó)藥典》2010年版收錄的龍膽藥材根部較小，其主要藥理成分龍膽苦苷在六葉龍膽各個(gè)部位有所不同，其中以花中含量最大，為2.91%，根中次之，為1.74%，莖葉中龍膽苦苷含量較低，提示應(yīng)在盛花期7～9月份采挖。

3.4 六葉龍膽入藥部位

六葉龍膽資源主要在秦嶺高海拔區(qū)域分布，六葉龍膽植株較小且全草均含有龍膽苦苷，總體含量在1.0%以上，考慮到藥用植物資源的充分利用，建議以全草入藥，考慮到六葉龍膽往年生的干枯植株根系中龍膽苦苷含量?jī)H為0.1%，故建議在六葉龍膽產(chǎn)地加工時(shí)需把根部干枯的植株根系剔除。

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Determination of gentiopicroside in different parts of the Gentiana hexphylla by HPLC

SUN Xiao1GUO Yaowu2YANG Ruirui2
1.Shaanxi University of Chinese Medicine,Shaanxi Province,Xianyang712046,China;2.Shaanxi Institute for Food and Drug Control,Shaanxi Province,Xi′an710065,China

Objective To compare gentiopicroside content in different parts of the Gentiana hexphylla by HPLC,and in order to compare the content of gentiopicrin in different parts.Methods The HPLC analysis was performed on a CAPCELL PAK C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm)with methanol-0.5%acetic acid(25∶75)as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min;the detection wavelength was at 270 nm;the column oven temperature was set at 32℃.Results The gentiopicroside content showed good linear in the range of 0.5-6.9 μg,regression equation:Y=1.2908×106X+4.8047× 104,correlation coefficient(r)=0.9999.The average recovery was 98.56%,RSD=1.01%(n=6).The sequence of gentiopicroside content was flower＞root＞stem＞leaf＞wither.Conclusion The method of HPLC is quick,simple,accurate,reliable and good precision.There are obvious differences between the kind of different parts of Gentiana hexphylla. [Key words]HPLC;Gentiana hexaphylla;Different parts;Gentiopicroside

R284.1

B

1673-7210（2014）09（a）-0095-04

2014-05-23本文編輯：衛(wèi)軻）

國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)課題（編號(hào)201207002）；陜西省中醫(yī)管理局中醫(yī)藥科研課題（編號(hào)13-ZY054）。

孫曉（1988.2-），男，陜西中醫(yī)學(xué)院2012級(jí)中藥學(xué)專(zhuān)業(yè)在讀碩士研究生。

郭耀武（1963.5-），男，陜西西安人，主任藥師，碩士研究生導(dǎo)師，陜西省食品藥品檢驗(yàn)所質(zhì)量管理科科長(zhǎng)；研究方向：中藥資源與開(kāi)發(fā)利用。