面包蝦中副溶血性弧菌溫度預測模型的建立

賀 群，黃 和，*，劉 亞，蔣志紅，勵建榮

（1.廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室，廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088；2.渤海大學，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧錦州121013）

面包蝦中副溶血性弧菌溫度預測模型的建立

賀 群1，黃 和1，*，劉 亞1，蔣志紅1，勵建榮2

（1.廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室，廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088；2.渤海大學，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧錦州121013）

為探討面包蝦生產過程中副溶血性弧菌的生長規律，測定了不同溫度（10、14、18、22、26、30、37℃）下副溶血性弧菌的生長曲線，運用Origin8.0軟件和DMFit軟件，分別采用修正Gompertz模型、修正Logistic模型、Baranyi模型對生長曲線進行擬合，建立初級模型。應用平方根模型對由最適生長模型得出的最大比生長速率進行擬合，建立二級生長預測模型。研究結果表明，通過模型檢驗比較，修正Gompertz模型模型對7種溫度培養條件下的擬合度較好（決定系數=0.9917），進一步擬合所得二級模型擬合度較好（決定系數=0.9687），得到了最適生長方程，可用于10～37℃溫度條件下的面包蝦中副溶血性弧菌生長預測。

面包蝦，副溶血性弧菌，生長模型

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是革蘭氏陰性嗜鹽菌，廣泛分布于世界各地溫暖的海洋環境中，人類感染的主要臨床癥狀是胃腸炎。自1998年以來，國家食源性疾病監測網的數據顯示，副溶血性弧菌引發的食物中毒超過沙門氏菌躍居首位[1]。國內外對副溶血性弧菌預測模型的研究主要集中在初級和二級模型，盧曉鳳[2]、田金玲等[3]研究了蛤肉、模擬蟹肉中副溶血性弧菌不同溫度條件下的生長規律，Gompertz方程擬合度較高。Zwietering等[4]比較了Gompertz和其他方程后，認為只有修正Gompertz方程更能充分描述細菌生長曲線。姬華等[5]采用修正Gompertz模型、修正Logistic模型、Baranyi模型對肉湯和對蝦中副溶血性弧菌的生長曲線進行擬合，發現擬合度都較高。Miles等[6]建立了不同培養條件下肉湯中副溶血性弧菌生長速率的平方根模型，Soon等[7]在Miles等的研究基礎上，建立了肉湯和牡蠣勻漿中副溶血性弧菌的生長動力學模型，修正Gompertz方程和平方根模型擬合度都較高。

副溶血性弧菌的感染主要是由于生食或誤食未煮熟或加工過程中再污染的海產品，尤其是蝦[8]。對蝦作為我國水產品出口創匯的拳頭產品[9]，在2005年初美國對我國初級冷凍蝦類產品開始征收高額反傾銷稅后，出口嚴重受阻，面包蝦作為一種鮮蝦的深加工產品，帶動了我國整個蝦類產品的出口。面包蝦在生產過程中除去低溫幾乎沒有任何的抑菌工序，因此，通過探討副溶血性弧菌在面包蝦表面的生長規律，特別是探討其在面包蝦中不同溫度培養條件下的生長模型的構建，對開展副溶血性弧菌的風險評估和完善面包蝦加工技術具有理論指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

副溶血性弧菌（ATCC17802） 廣東省微生物研究所，菌株在含3%NaCl和20%甘油的腦心浸液肉湯（BHI）中于-80℃保存，菌株接種于2.5%NaCl胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）中，37℃培養箱中培養16～20h，活化3代備用；腦心浸液肉湯（BHI）、TCBS瓊脂、3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂（2.5%NaCl TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、3%氯化鈉堿性蛋白胨水、營養瓊脂（NA） 均購自青島海博生物技術有限公司；NaCl分析純 廣東省光華科技股份有限公司。

LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌器 上海華線醫用核子儀器有限公司；XW-80A旋渦混合器 海門其林貝爾儀器制造有限公司；拍擊式均質器 西班牙IUL公司；SPX-250B-Z型生化培養箱（5～50℃，±1.5℃） 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；LTI-700型低溫恒溫培養箱（-20～70℃） 上海愛朗儀器有限公司；電子天平 日本島津公司；1mL、200μL移液槍 德國Eppendorf公司；BCD-277冰箱 博西華家用電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備 將副溶血性弧菌劃線接種于TCBS平板，挑取典型綠色斗笠狀菌落，接種至含有9mL 2.5%NaCl TSB的試管中，37℃、120r/min培養12h，利用無菌的2.5%NaCl TSB培養基的調節菌液OD600為0.5[5]，用無菌3%NaCl堿性蛋白胨水梯度稀釋，選擇10-4稀釋度作為添加的菌懸液。

1.2.2 實驗用無菌面包蝦的制備[5，10]將面包蝦分裝于高壓平口袋中，約40g/包，真空包裝，面包蝦在400MPa、28℃下處理20min。超高壓處理后準確稱取10g面包蝦于無菌均質袋中，加入90mL無菌3%氯化鈉堿性蛋白胨水，均質機拍打90s，吸取100μL面包蝦勻漿液，采用傾注平板法倒3%NaCl NA和2.5%NaCl TSA平板，37℃培養48h，不長菌代表超高壓處理殺死了所有的雜菌。將無菌的面包蝦置于-18℃冰箱中備用。

1.2.3 副溶血性弧菌的接種、培養及計數[5]無菌稱取10g無菌面包蝦置于直徑為90mm無菌培養皿中，每份蝦仁用無菌槍頭均勻接種菌懸液100μL，接種后使面包蝦的初始菌數達到101～103cfu/g。

接種完畢后，分別置于10、14、18、22、26、30、37℃生化培養箱中培養。根據培養溫度，在選定的時間取出樣品采用平板計數法測菌數。

1.2.4 生長模型的建立 一級模型的擬合采用Origin 8.0軟件和DMFit軟件（http：//modelling.combase.cc/ DMFit.aspx），分別用修正Gompertz模型、修正Logistic模型、Baranyi模型擬合面包蝦在不同溫度下實際測得的副溶血性弧菌濃度隨時間變化的生長曲線，再做對比，選出最適模型，三種模型的方程分別為：

式（1）、式（2）中，logNt是在時間t時菌落計數的對數值[log（cfu/mL）]；A即初始菌量的對數值logN0[log（cfu/mL）]；C是初始菌量和最大菌量之間的差值[log（cfu/mL）]；M是生長速率達到最大值時的時間（h）；B是在時間M時的相對最大生長速率（h-1）。

式（3）中，y0和ymax分別是細菌的初始菌量和最大菌量；μm是最大比生長速率（h-1）；tlag是遲滯期。

修正Gompertz模型、修正Logistic模型生長參數參照姬華等[4]的μm、tlag來計算。

將μm作為溫度的函數建立模型，采用Ratkowsky等描述的平方根模型[13]，模型方程為：

式（4）中，μm是最大比生長速率，a是回歸系數，Tmin是細菌出現生長的理論最低溫度。根據初級最適模型求得μm，將μm和對應的溫度代入方程式，擬合出b和Tmin，然后代入原方程，求得二級模型。二級模型采用Origin 8.0軟件擬合。

1.2.5 模型的檢驗 一級模型的擬合優度采用決定系數R2評價。二級模型采用殘差平方和（RSS）、平方根誤差（RMSE）、偏差因子（Bf）和準確性因子（Af）來評定[12]，表達式如下：

式中，μobs和μpred分別最大比生長速率的觀測值和預測值，n為實驗次數。

1.2.6 數據處理 對不同時間菌落計數的對數值與初始菌數對數值的差值lg（Nt/N0），采用Origin 8.0軟件擬合修正Gompertz方程和修正Logistic方程，用DMFit軟件擬合方程，通過比較決定系數R2確定最適模型。

表1 修正Gompertz模型、修正Logistic模型參數及統計分析Table 1 Statistic analysis of growth parameters of modified Gompertz model and modified Logistic model

表2 Baranyi模型參數及統計分析Table 2 Statistic analysis of growth parameters of Baranyi&Robert model

2 結果與分析

2.1 副溶血性弧菌一級生長模型的建立

修正Gompertz模型、修正Logistic模型對副溶血性弧菌在10、14、18、22、26、30、37℃的生長曲線進行擬合，由Origin 8.0軟件計算出擬合方程的各個參數，如表1所示。

使用Baranyi模型對副溶血性弧菌在10、14、18、22、26、30、37℃的生長曲線進行擬合，DMFit軟件同時還計算出了模型的兩個變量生長速率μm和遲滯期tlag以及擬合曲線的標準差s和決定系數R2，所得的參數及統計分析如表2所示。

實驗結果表明，修正Gompertz模型、修正Logistic模型、Baranyi模型擬合，均能得到較高的決定系數，決定系數均值分別為0.9917、0.9882、0.9867，選用修正Gompertz模型得出的參數進一步建立二級模型，以lg（Nt/N0）對時間t作圖，副溶血性弧菌的一級模型擬合曲線如圖1所示。由圖1可以看出，隨著溫度的升高，微生物的最大比生長速率也隨之升高。

2.2 副溶血性弧菌二級生長模型的建立

將不同溫度下修正Gompertz模型擬合得到的最大比生長速率μm代入Ratkowsky方程擬合，即得到最

從圖2中可以看出，10～37℃溫度范圍內，副溶血性弧菌的比生長速率的平方根與溫度呈線性關系，并隨著溫度的升高而增加，擬合方程的決定系數R2達到了0.9687。

比生長速率的預測值與實測值的殘差平方和（RSS）、平方根誤差（RMSE）、偏差因子（Bf）、準確性因子（Af）見表3。大生長速率-溫度的二級模型，擬合曲線見圖2。

表3 比生長速率的預測值與實測值的統計學分析Table 3 Statistic analysis of μmbetween predicted value and observed value

從實驗結果可以看出，二級模型具有較高的R2和較低的RSS值，表明Ratkowsky平方根模型對生長速率的擬合度較好，通過數學參數檢驗，比較μm的預測值與實測值，可以計算出偏差因子和準確因子，從上表可以看出，RMSE值較小，預測值和實測值的偏差很小，偏差因子Bf接近于1；準確因子Af也接近于1，表明模型的擬合效果好，準確度高，能很好地預測面包蝦中副溶血性弧菌的生長。

圖1 在10、14、18、22、26、30、37℃條件下面包蝦中副溶血性弧菌的一級生長模型Fig.1 The primary growth model for Vibrio parahaemolyticus in Bread Shrimp at 10，14，18，22，26，30 and 37℃

圖2 最大生長速率和溫度二級模型擬合曲線圖Fig.2 Fitted curve of groeth rate and temperature of the secondary model

3 結論與討論

本實驗研究了10～37℃下面包蝦中副溶血性弧菌的生長規律，建立了副溶血性弧菌生長的初級模型和二級模型，修正Gompertz模型較好的擬合了實驗數據，這與對蝦、牡蠣勻漿中副溶血性弧菌生長曲線的擬合結果相似，由此進一步擬合的平方根模型，擬合度較高，通過數學參數檢驗得出，RMSE值較低，偏差因子和準確因子均接近于1，驗證了本實驗建立的模型的可靠性。企業在流通、加工過程中，可以通過此模型對整個生產流程和銷售過程的時間進行有效的控制，從而達到更好地控制副溶血性弧菌生長的效果，并可作為面包蝦質量安全的有效保證，為面包蝦的出口起到保障作用，最終增強在國內外市場上的競爭力。

影響副溶血性弧菌生長的因素有溫度、pH、鹽度、水分活度等因素，溫度是主要的影響因素之一。本實驗著重研究了不同溫度條件下面包蝦中副溶血性弧菌生長規律，建立了可靠的預測模型來描述溫度對副溶血性弧菌生長速率的影響，對面包蝦的生產銷售環節有一定的理論指導意義。今后將就低溫儲藏、鹽度、pH等對面包蝦中的副溶血性弧菌生長的影響做進一步的研究，以期能通過多種模型的比較選擇來建立完整的面包蝦中副溶血性弧菌的預測模型。

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Establishment of growth predictive model of Vibrio parahaemolyticus in bread shrimp

HE Qun1，HUANG He1，*，LIU Ya1，JIANG Zhi-hong1，LI Jian-rong2
（1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety，Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution，College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China；2.Food Safety Key laboratory of Liaoning Province，Bohai University，Jinzhou 121013，China）

To study the growth law of V.parahaemolyticus in the process of bread shimp，growth curves under different temperatures（10，14，18，22，26，30，37℃，respectively）were determined.The modified Gompertz，modified Logistic and Baranyi models，respectively，were applied to fit the growth curves by Origin 8.0 software and DMFit software，and the primary model was established.The root-squaring model were used to fit the maximum specific growth rates obtained by the optimum growth model for the establishment of the secongary model.Results showed that the modified Gompertz model was more accurate and useful in fitting V.parahaemolyticus growth curves than the modified Logistic and Baranyi&Robert models，respectively（R2= 0.9917）.And the secondary model had a high goodness-of-fit（R2=0.9687）.The optimum growth equations were obtained.The modified Gompertz model coulde be used for predicting the growth of V.parahaemolyticus in Bread Shrimp under above temperature condition.

bread shrimp；Vibrio parahaemolyticus；growth model

TS201.3

A

1002-0306（2014）08-0088-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.010

2013－08－19 *通訊聯系人

賀群（1987-），女，在讀碩士研究生，研究方向：食品質量與安全。

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD29B06）；廣東省省部產學研結合項目（2011B090400154）；湛江市科技計劃項目（湛科[2010]174號）。