卵白蛋白多肽的酶解制備及抗氧化活性研究

宋宏新，秦 婧，薛海燕，賀寶元

（1.陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西西安710021；2.陜西科技大學資源與環境學院，陜西西安710021）

卵白蛋白多肽的酶解制備及抗氧化活性研究

宋宏新1，秦 婧1，薛海燕1，賀寶元2

（1.陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西西安710021；2.陜西科技大學資源與環境學院，陜西西安710021）

以DPPH自由基清除率和水解度為指標，采用堿性蛋白酶酶解卵白蛋白制備抗氧化活性肽，考察底物質量分數、酶解時間、加酶量、溫度等因素對制備的影響。正交實驗結果表明，堿性蛋白酶的最佳水解條件為：底物質量分數4%、酶解時間6h、加酶量5500U/g，溫度65℃，此條件下DPPH自由基清除率達到96.92%、水解度為57.14%。酶解時間對DPPH自由基清除率的影響最大，而底物質量分數對水解度的影響最大。

卵白蛋白，堿性蛋白酶，抗氧化活性

卵白蛋白是蛋清中的最主要的蛋白質，其含量占蛋清總蛋白質的54%，營養價值較高、加工與生物學性能良好，在免疫學研究和動物細胞培養及抗體制備中有重要作用[1-2]。卵白蛋白酶解后得到的多肽具有多種生理活性，如抗氧化肽、降壓肽、抗菌肽、免疫肽等。抗氧化肽不僅具有多肽產品的營養作用，且具備抗氧化和清除自由基的功能，幫助機體消除多余的自由基、增強人體抗衰老、抗疾病能力[3-4]。Davalos等研究發現，卵白蛋白酶解物具有強抗氧化活性分離出具較強抗氧化性的多肽Tyr-Ala-Glu-Glu-Arg-Tyr-Pro-Ile-Leu[5]。周國儀等純化雞卵清蛋白多肽，得到了兩組對DPPH自由基清除能力較強的組分，清除率分別為84.02%和81.17%，分子量分別集中在180u左右200u左右[6]。沈勇根等用胃蛋白酶水解卵白蛋白得到了抗氧化能力較強的3個肽分別是源于雞蛋卵白蛋白第115～117氨基酸殘基（Pro-Glu-Tyr），分子質量408.14u；第245～248氨基酸殘基（Leu-Pro-Asp-Glu），分子質量473.19u；第148～150氨基酸殘基（Trp-Val-Glu），分子質量433.18u[7]。可見來源于蛋清源的抗氧化肽，不但具有良好的抗氧化活性，且安全性極高，因而在保健食品以及生物醫藥領域的應用前景十分廣闊。

卵白蛋白分子不耐酶解，由385個氨基酸殘基組成，其中50%以上為疏水氨基酸，而堿性蛋白酶有水解疏水性氨基酸的專一性，主要裂解的疏水性氨基酸如：Leu、Ile、Val等。卵白蛋該酶水解位點相符合。故本研究采用堿性蛋白酶酶解卵白蛋白，對其酶解物的抗氧化活性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

卵白蛋白A5253（純度62%～88%） Sigma公司；堿性蛋白酶（酶活≥200000U/g） 北京奧博興生物技術有限公司；二苯基苦基苯肼（DPPH，分析純）Sigma公司；無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸等 均為分析純。

752型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；HC-3081型高速冷凍離心機 安徽中科中佳儀器有限公司；酸度計 北京賽多利斯儀器系統有限公司；恒溫水浴鍋（HH-1） 常州國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 堿性蛋白酶水解方法 溶解卵白蛋白粉→用氫氧化鈉調pH至10→將樣品置于水浴鍋里，待樣品溫度升至酶解溫度時加酶→酶解一定時間→用鹽酸調pH至5滅酶→離心→取上清液待測。

1.2.1.1 底物質量分數 固定時間5h、加酶量6500U/g、溫度55℃，底物質量分數3%、4%、5%、6%，考察底物質量分數對DPPH自由基清除率和水解度的影響。

1.2.1.2 酶解時間 固定底物質量分數4%、加酶量6500U/g、溫度55℃，分別酶解3、4、5、6h，考察酶解時間對DPPH自由基清除率和水解度的影響。

1.2.1.3 加酶量 固定底物質量分數4%、時間5h、溫度55℃，加酶量4500、5500、6500、7500U/g，考察加酶量對DPPH自由基清除率和水解度的影響。

1.2.1.4 酶解溫度 固定底物質量分數4%、時間5h、加酶量6500U/g，溫度45、55、65℃，考察酶解對DPPH自由基清除率和水解度的影響。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 DPPH自由基清除率測定 抗氧化活性測定采用測定DPPH自由基清除率[8]。準確稱取10mg DPPH溶于100mL無水乙醇得儲備液，冰箱避光保存。用時稀釋4倍得6.5×10-5mol/L DPPH·溶液，另將待測抗氧化劑配制成系列溶液。對照組：2.5mL的6.5×10-5mol/L DPPH乙醇溶液+0.5mL蒸餾水；樣品：2.5mL的6.5×10-5mol/L DPPH乙醇溶液+0.5mL樣液；空白組：2.5mL無水乙醇溶液+0.5mL樣液。各組反應10min后1cm比色皿517nm下測定吸光值。重復測定3次，結果取平均值。然后按下式計算：

清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

式中：A0為對照組吸光值；Ai為樣液吸光值；Aj為未加DPPH的空白組吸光值。

1.2.2.2 指標的測定 水解度測定：水解度（%）=（氨基態氮/總氮）×100；

氨基氮測定：采用甲醛滴定法[9]。分別吸取10mL不同水解度的水解液于100mL燒杯中加蒸餾水60mL，開動磁力攪拌器，用0.050mol/L氫氧化鈉標準溶液滴定至pH=8.20時停止攪拌，加入甲醛10mL（pH=9.20），用磁力攪拌器混勻，再用0.050mol/L NaOH滴定至pH=9.20，記下加入甲醛后消耗的0.050mol/L氫氧化鈉體積（mL），同時做空白實驗。

式中：V：樣品耗用氫氧化鈉標準溶液毫升數；V0：空白耗用氫氧化鈉標準溶液毫升數；N：氫氧化鈉標準溶液摩爾濃度。

總氮測定：采用微量凱氏定氮法[10]。

1.2.3 正交實驗 以DPPH自由基清除率和水解度為指標，以底物質量分數、酶解時間、加酶量、溫度為考察因素，取三個水平，進行L9（34）正交設計實驗，確定堿性蛋白酶酶解卵白蛋白的最佳工藝條件，并對最優組合進行驗證實驗。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of experiment

2 結果與討論

2.1 各因素對DPPH自由基清除率和水解度的影響

2.1.1 底物質量分數對DPPH自由基清除率和水解度的影響 如圖1所示，DPPH自由基清除率、水解度隨著底物質量分數的增大而先升高后降低，在底物質量分數為4%時兩者均達到最大分別為87.67%和72.45%。當底物質量分數在3%～4%，兩者都迅速提高，這說明底物質量分數較低時，較低的底物量不足以與酶完全反應，故增大底物質量能夠加快酶催化反應速率，所以增加底物質量分數二者都急劇增加；當底物質量分數繼續增大超過4%時，二者都呈現降低的趨勢，可能因酶的活性中心已被底物飽和，再增加底物質量分數，反應速度也不再增加，而且還有一定程度的抑制作用。底物質量分數初步定為4%。

圖1 底物質量分數對DPPH自由基清除率和水解度的影響Fig.1 Effect of ovalbumin concentration on DPPH radical scavenging and degree of hydrolysis

2.1.2 酶解時間對DPPH自由基清除率、水解度的影響 如圖2所示，DPPH自由基清除率隨著酶解時間的延長而先增大后減小，在酶解3～5h時，DPPH清除率顯著提高，并在5h達到最高為90.18%，后又下降。水解度則隨著時間延長而一直上升，在6h達到最大為80.84%。在3～5h時，二者均提升顯著是因為酶與底物充分結合反應迅速；而5～6h時，酶與底物依然結合充分故水解度依然上升，但DPPH清除率下降可能是因為已經形成的抗氧化肽已被部分氧化，從而引起產物結構的變化，致使DPPH清除率下降。綜合考慮選擇酶解時間5h。

圖2 酶解時間對DPPH自由基清除率和水解度的影響Fig.2 Effect of contact time on DPPH radical scavenging and degree of hydrolysis

2.1.3 加酶量對DPPH自由基清除率、水解度的影響 加酶量對DPPH自由基清除率的影響如圖3所示。由圖3可見，DPPH自由基清除率隨著加酶量的增加先上升后下降，在4500～6500U/g時，DPPH清除率顯著提升，并在6500U/g達到最高為85.33%。水解度隨著加酶量的增加呈上升趨勢，在7500U/g達到最大為73.46%。在4500～6500U/g時，二者均提升顯著是因為酶進行催化反應時首先要與底物形成一個中間物即酶-底物復合物，而這一步驟正是整個反應的限速步驟，當底物濃度大大超過酶濃度時，這種中間物的生成速度取決于酶的濃度，所以此時增加酶的量，中間物生成速度加快，從而整個反應的速度也加快；加酶量大于6500U/g后，水解度進一步提升，而DPPH清除率下降，雖然水解度提高使得總多肽含量增加但水解出的具有抗氧化活性的多肽反而減少，說明抗氧化活性與一定的肽結構和分子量有關；再者，也有研究報道[11]，酶量過高時，由于酶本身的相互水解作用加強，也會阻礙酶對底物的水解。綜合考慮加酶量初步定為6500U/g。

圖3 加酶量對DPPH自由基清除率和水解度的影響Fig.3 Effect of enzyme content on DPPH radical scavenging and degree of hydrolysis

2.1.4 溫度對DPPH自由基清除率、水解度的影響 眾所周知，在蛋白酶酶底物過程中有一個最適的反應溫度，在一定范圍內升高溫度，底物轉變成產物的速度加快，酶解效率也相應提高，表現在水解度上則呈增加趨勢[12]。如圖4所示，DPPH自由基清除率開始隨著溫度的升高先升高后下降，在55℃達到最高為85.81%，后又下降。水解度則隨著溫度的升高而升高，在65℃達到最高為72.81%。由于溫度升高，使得酶催化反應速度加快，在相同時間內的水解度提高，但DPPH清除率下降，可能是因為溫度過高影響了已經生成的抗氧化肽的活性。綜合考慮選擇酶解溫度55℃。

圖4 溫度對DPPH自由基清除率和水解度的影響Fig.4 Effect of temperature on DPPH radical scavenging and degree of hydrolysis

2.2 正交實驗結果

根據根據實驗結果，獲得實驗直觀分析表見表2。

表2 正交實驗結果Table 2 The results of orthogonal experiment

由表2可知，影響卵白蛋白酶解物DPPH清除率的各因素先后順序為：B＞D＞A＞C，即酶解時間＞酶解溫度＞底物質量分數＞加酶量，最優組合是A2B3C1D3，即底物質量分數4%、酶解時間6h、加酶量5500U/g，溫度65℃。經過驗證實驗測得該條件下，DPPH自由基清除率達到96.92%、水解度為57.14%。

影響卵白蛋白酶解物水解度的因素先后順序為：A＞B＞C＞D，即底物質量分數＞酶解時間＞加酶量＞酶解溫度，最優組合是A3B1C3D3，即底物質量分數5%、酶解時間4h、加酶量7500U/g，溫度65℃。該組合未出現在正交表中，經過驗證實驗測得DPPH自由基清除率為68%、水解度達到95.77%。

由于卵白蛋白酶解物水解度主要與底物質量分數有關，而DPPH自由基清除率則受酶解時間的影響最大，而以水解度為指標的制備工藝優化，并不能獲得高自由基清除率的最佳條件，因此在工藝控制中應以抗氧化能力為衡量指標。故選定最佳組合為A2B3C1D3，即底物質量分數4%、酶解時間6h、加酶量5500U/g，溫度65℃。

2.3 驗證實驗

采用底物質量分數4%、酶解時間6h、加酶量5500U/g，溫度65℃的酶解條件進行驗證實驗，結果見下表3。

表3 驗證實驗結果Table 3 Results of the verification experiment

即最佳酶解工藝條件為：底物質量分數4%、酶解時間6h、加酶量5500U/g，溫度65℃。在此條件下，DPPH自由基清除率達到96.92%、水解度為57.14%。

3 結論

3.1 堿性蛋白酶酶解卵白蛋白的抗氧化活性研究中，對DPPH自由基清除率的影響因素先后順序為：酶解時間＞酶解溫度＞底物質量分數＞加酶量；對水解度的影響因素先后順序為：底物質量分數＞酶解時間＞加酶量＞酶解溫度。

3.2 實驗得出堿性蛋白酶水解卵白蛋白制備抗氧化活性肽的最佳工藝條件：底物質量分數4%、酶解時間6h、加酶量5500U/g，溫度65℃，此時，DPPH自由基清除率達到96.92%、水解度為57.14%，可見堿性蛋白酶酶解卵白蛋白的酶解物具有較強的抗氧化活性。

[1]Masayuki Y，Nobuyuki，Masaaki H.Crystal structure of S-ovalbumin as a non-loop-interted thermostabilized serpin form [J]．Journal of Biological Chemistry，2003，278（37）：35524-35530．

[2]Mine Y，Noutomi T，Haga N.Emulsifying and structural properties of ovalbumin[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1991，39（3）：443-446．

[3]Decker EA，Crum AD.Inhibition of oxidative rancidity in salted ground pork by Camosine[J].J Food Sci，1991，56（5）：1179-1183．

[4]芮銘安，王曹峰，方晶，等．還原型谷胱甘肽和膽寧片治療非酒精脂肪肝的臨床療效比較[J].中國藥科醫學，2001，4（4）：269-270.

[5]Davalos A，Miguel M，Bartolome B，et al.Antioxidant activity of peptides derived from egg white proteins by enzymatic hydrolysis [J].J Food Prot，2004，67（9）：1939-1944.

[6]周國儀，成靜，陳棟梁，等.雞卵清蛋白多肽的純化及抗氧化作用的研究[J].食品科學，2009，30（15）：30-32.

[7]沈勇根，徐明生，尹忠平，等.卵白蛋白抗氧化肽分離與純化[J].中國食品學報，2011，8（11）：16-22.

[8]HEO S J，PARK E J，LEE K W，et al.Antioxidant activities of enzymaticextractsfrom brown seaweeds[J].Bioresource Technology，2005，96：1613-1623.

[9]寧正祥.食品成分分析手冊[M].北京：中國輕工業出版社，1998：120-121.

[10]GB/T 5009.5-2010食品中蛋白質的測定[S].北京：中國標準出版社，2010.

[11]翟瑞文，李雁群，陳子林，等.玉米面筋的酶水解[J].食品工業，1997（3）：7-8.

[12]王彩云，荊瑩，石丹，等.酶解酪蛋白制備易于消化吸收肽的工藝研究[J].中國乳品工業，2012，40（3）：18-21.

Study on preparation and antioxidant activity of peptides derived from ovalbumin

SONG Hong-xin1，QIN Jing1，XUE Hai-yan1，HE Bao-yuan2
（1.College of Life Science and Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi’an 710021，China；2.College of Resource and Environment，Shaanxi University of Science and Technology，Xi’an 710021，China）

In the experiment，ovalbumin was hydrolyzed by alkaline protease to obtain antioxidant peptide.Using DPPH radical scavenging activities and degree of hydrolysis as index，single factors including substrate concentration，enzymolysis time，enzyme concentration and enzymolysis temperature，were applied to research their influences on the preparation.Orthogonal experiment showed the most suitable condition of alkaline protease to hydrolyze ovalbumin was substrate concentration of 4%，enzymolysis time of 6h，alkaline protease of 5500U/g，enzymolysis temperature of 65℃ respectively.In this condition，DPPH radical scavenging rates reached 96.92%，and degree of hydrolysis was 57.14%.Enzymolysis time had the greatest influence on DPPH radical scavenging activities and substrate concentration had the greatest influence on degree of hydrolysis.

ovalbumin；alkaline protease；antioxidant activity

TS201.1

A

1002-0306（2014）08-0153-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.026

2013－08－17

宋宏新（1959-），男，碩士研究生，教授，研究方向：食品營養與安全。

國家自然科學基金項目（31301405）；陜西省自然科學基礎研究計劃項目（2012JM2009）；陜西省教育廳自然科學專項項目（2012JK0655）。