轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶改善大豆11S球蛋白聚合的研究

劉 穎，徐錦麗，瑙阿敏，鄭智超，竇博新

（哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱150076）

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶改善大豆11S球蛋白聚合的研究

劉 穎，徐錦麗，瑙阿敏，鄭智超，竇博新

（哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱150076）

研究了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（Transglutaminase，TGase）改善大豆11S蛋白聚合的條件。采用堿性蛋白酶酶解大豆蛋白11S，再利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對酶解后的大豆蛋白11S進行聚合，得知改性后大豆蛋白11S聚合物的分子量15ku左右。加酶量在30U/g時，TGase對催化大豆蛋白11S聚合效果最佳，加酶量過高或過低均不利于反應。離子強度I=0.2時有利于聚合物的形成。pH在8.0～9.0之間有利于聚合物的形成。反應溫度在45℃左右有利于TGase酶發(fā)揮活性使得聚合物更易形成。改性前乳化性及其穩(wěn)定性分別是30.27%和37.78%，改性后乳化性及其穩(wěn)定性分別是61.15%和79.28%。

大豆蛋白11S，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，酶改性，乳化性及乳化穩(wěn)定性

大豆蛋白質(zhì)是人類最豐富和最經(jīng)濟的植物蛋白質(zhì)資源[1]。大豆蛋白中球蛋白占總蛋白的50%～90%，其主要成分為大豆球蛋白（glycinin，主要是11S）和β-伴球蛋白（β-conglycinin，主要是7S），兩者合在一起約占大豆球蛋白的70%，是大豆中的儲藏蛋白。11S大豆蛋白等電點是pH4.64。pH4.64時，溶解度隨離子強度和溫度而變化。在工業(yè)生產(chǎn)和實驗研究中[2]，豆?jié){中形成了許多11S蛋白的多聚體，都可以破壞二硫鍵的作用，可以提高蛋白質(zhì)的濃度和溶解度。

轉(zhuǎn) 谷 氨 酰 胺 酶（Transglutaminase，TGase；EC2.3.2.13；全稱為蛋白質(zhì)-谷氨酰胺-γ-谷氨酰胺基轉(zhuǎn)移酶）是一種能催化多肽或蛋白質(zhì)的谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基團（酰基的供體）與許多伯胺化合物（酰基的受體，包括蛋白質(zhì)賴氨酸殘基的ε-氨基）之間的酰基轉(zhuǎn)移反應的酶[3]。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶廣泛存在于動物、植物和微生物中[4-6]。微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（MTGase）屬于胞外酶，等電點為pH8.9，最適pH是5～ 8，最適溫度50℃，其活性不依賴Ca2+。食品中蛋白質(zhì)如酪蛋白、大豆球蛋白、肌蛋白都對Ca2+敏感，在Ca2+存在下易沉淀，對酶的反應性降低[7-9]不同來源的TGase理化特性具有一定的差異。哺乳動物來源的TGase催化活性高，但其來源少，分離純化工藝復雜，熱穩(wěn)定性差，使之不可能在食品工業(yè)中廣泛應用[10]。國外已有學者研究了TGase催化蛋白交聯(lián)作用機制研究中，Nonaka等[11]最早報道了TGase能催化大豆球蛋白聚合，之后相繼有學者研究了TGase催化大豆蛋白的交聯(lián)反應。Chanyongvorakul等[12]研究了大豆11S球蛋白經(jīng)TGase催化的交聯(lián)反應，結果顯示TGase僅能催化11S球蛋白的酸性亞基通過形成分子間的交聯(lián)而產(chǎn)生聚合。本文主要研究TGase催化酶解后的大豆11S球蛋白交聯(lián)的不同反應條件，并且討論了改性前后大豆11S球蛋白乳化性及其穩(wěn)定性的變化情況。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂大豆蛋白 哈爾濱高科技（集團）股份有限公司；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 合肥博美生物科技有限責任公司；Alcalase堿性蛋白酶（活力≥200000U/g） 北京奧博星生物技術有限責任公司；N-芐氧羰基-L-谷氨酰甘氨酸（N-α-CBZ-Gln-Gly）、還原型谷胱甘肽、L-谷氨酸γ-單羥肟酸（L-Glutamic acid γmonohydroxamic acid）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、N，N，N’，N’-四甲基乙二胺（TEMED）、鹽酸羥胺（hydroxylamine） Sigma公司；丙烯酰胺（超純）、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺（超純）、巰基乙醇 Amresco公司；甘油 天津市致遠化學試劑有限公司；過硫酸銨 西隴化工股份有限公司。

Spectrum722E型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；80-2型高速離心機 上海浦東物理光學儀器廠；SY-2-4型恒溫水浴鍋 天津市歐諾儀器儀表有限公司；BG-verMINI型迷你垂直電泳儀北京百晶生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的酶活測定 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性采用Folk等報道[13]的分光Hydroxamate分析法測量。最終反應物包含0.1mol/L Tris-HCl緩沖液，pH6.0，30mmol/L N-α-CBZ-Gln-Gly，0.1mol/L hydroxylamine。于37℃與0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/mL酶溶液反應10min后添加氯化鐵/三氯醋酸試劑（0.7%，w/v）終止酶反應。離心去除沉淀，所形成的紅色于525nm測定吸光度，重復三次平行實驗。用L-Glutamic acid γmonohydroxamic acid作標準曲線。單位轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活力（U）定義為每min產(chǎn)生1μmol/L羥肟酸（hydroxamic acid）所需的酶量。

1.2.2 大豆蛋白11S制備 按照Nagano等[14]的方法從原料大豆蛋白粉中提取大豆蛋白11S。

1.2.3 堿性蛋白酶酶解11S 配制1.0%蛋白溶液加入40U/g的Alcalase堿性蛋白酶于37℃條件下恒溫酶解反應1h。

1.2.4 不同條件對大豆蛋白11S聚合的影響

1.2.4.1 加酶量對大豆蛋白11S聚合的影響 酶反應體系為溶于0.05mol/L緩沖液（pH7.5）的1.0%大豆蛋白溶液。分別添加10、20、30、40、50U/g TGase酶，反應混合物于37℃，100r/min下恒溫酶解反應2h，三次平行實驗。反應后直接加入電泳樣品緩沖液，終止反應。進行SDS-PAGE，然后進行光密度掃描，以確定聚合后聚合產(chǎn)物含量的改變。

1.2.4.2 離子強度對大豆蛋白11S聚合的影響 酶反應體系為溶于不同離子強度（0.05、0.08、0.1、0.2、0.5mol/kg）的緩沖液的1.0%大豆蛋白溶液。添加20U/g TGase，反應混合物于37℃，100r/min下反應2h，三次平行實驗。反應后直接加入電泳樣品緩沖液中止酶反應。經(jīng)SDS-PAGE后，進行光密度掃描，確定聚合物含量的改變。

1.2.4.3 pH對大豆蛋白11S聚合的影響 酶反應體系為溶于不同pH（7.1、7.5、8.0、8.5、9.0）的緩沖液的1.0%大豆蛋白溶液。添加20U/g TGase酶蛋白，反應混合物于37℃，100r/min下反應2h，三次平行實驗。反應后直接加入電泳樣品緩沖液中止酶反應。經(jīng)SDSPAGE后，進行光密度掃描，確定聚合物含量的改變。1.2.4.4 反應溫度對大豆蛋白11S聚合的影響 酶反應體系為溶于0.05mol/L緩沖液（pH7.5）的1.0%大豆蛋白溶液。添加20U/g TGase酶，反應混合物于不同溫度（30、37、40、45、50℃）下100r/min分別反應2h，三次平行實驗。反應后直接加入電泳樣品緩沖液中止酶反應。SDS-PAGE后，進行光密度掃描，確定聚合物含量的改變。

1.2.5 改性后大豆蛋白11S乳化性及乳化穩(wěn)定性研究 用0.2mol/L pH7的磷酸鹽緩沖溶液配制1.0%的蛋白溶液100mL，以1∶1（v∶v）的比例加入100mL色拉油中，磁力攪拌器充分攪拌，形成均一的乳化液。倒入離心管中記下液面高度，在1500r/min的速度下離心10min，取出測量上層乳化層的高度，三次平行實驗，按下式計算乳化能力。

式中，EA—乳化性；L1—離心管乳化層高度；L—總高度。

將上述樣液繼續(xù)于1500r/min的速度下離心20min，測量殘留的乳化層高度，三次平行實驗，按下式計算乳化穩(wěn)定性：

式中，ES—乳化穩(wěn)定性；L2—殘留高度；L1—離心管乳化層高度。

2 結果與討論

2.1 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活標準曲線及酶活力

標準曲線的線性回歸方程是：y=0.933x+0.014，R2=0.9992。

式中：x為L-谷氨酸γ-單羥肟酸的濃度（mmol/mL），y為525nm處的吸光值。

酶活計算公式：

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活（U/mL）=（A+0.0049）×n/（0.1029×10×V）

式中：A：吸光值；n：酶的稀釋倍數(shù)；10：反應時間（min）；V：參加反應體積。

圖1 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶標準曲線Fig.1 Plot of TGase activity

經(jīng)測定，結果酶活為100U/mL。

2.2 大豆蛋白11S電泳圖

大豆蛋白11S組成比較單一，分子量為302000～375000，且有12個亞基，6個酸性亞基和6個堿性亞基構成的兩個環(huán)狀六角形結構，酸性和堿性亞基交互對應形成較穩(wěn)定的結構形式。圖2為按照Nagano方法從脫脂豆粉中制備大豆蛋白11S的SDS-PAGE電泳圖，圖譜中主要蛋白條帶所對應的亞基相對分子質(zhì)量與文獻報道相吻合。

圖2 大豆球蛋白11S電泳圖Fig.2 SDS-PAGE profiles of glycinin

2.3 加酶量對TGase催化大豆蛋白11S聚合的影響

酶的添加量對于酶促反應是很重要的。如果添加量少，那么可作用于催化的活性中心就少，再者在一定反應環(huán)境下，如酸性、堿性或者偏熱環(huán)境，會有酶失活的機會，即使反應時間長，也不會達到應有的催化效果。因此，一定要掌握最適合的加酶量。圖3為聚合物的SDS-PAGE電泳圖，從圖3中可以看到，聚合物分子量在15ku左右，隨后隨著加酶量的增加聚合物分子量變化不大。圖4為聚合物的相對光密度隨加酶量的變化，從圖4中可以看到隨著給酶量的增加，催化反應速度也在加快，當增加到30U/g蛋白的時候，催化反應基本完全。當繼續(xù)加酶時，光密度驟減。分析原因，可能是酶的量增加，使蛋白和酶碰撞的機會減少，而增加了酶和酶碰撞的機會，這樣會使暴漏的活性中心減少，那么底物蛋白就失去了被催化的機會，反應速度減慢。

圖3 不同加酶量下的大豆蛋白11S的SDS-PAGE圖譜Fig.3 SDS-PAGE profiles of glycinin，after adding TGase

圖4 不同加酶量下聚合物相對光密度圖Fig.4 Relative density of glycinin,after adding various amount of TGase

2.4 離子強度對TGase催化大豆蛋白11S聚合的影響

考慮設計離子子強度這一個考察因素主要從兩方面分析；一方面是鹽的濃度，也就是離子濃度的不同會影響大豆蛋白的溶解度。而底物蛋白的溶解性能是影響酶的催化活性的一個重要因素[15]。一定條件下大豆蛋白的溶解性會隨離子強度增加而增加，即使在較高離子強度下，大豆蛋白也能較完全的溶解。另一方面，不同的鹽濃度、鹽的種類也會影響酶的催化效果。從圖5中可以看到，離子強度的增加對聚合物分子量的改變不大，聚合物的分子量在15ku左右。但從圖6中可以看到隨著離子強度的增加聚合物的相對光密度先增加后減小，在離子強度=0.2時相對光密度達到最大，隨后隨著離子強度的增加相對光密度減小。這可能是因為如果溶解度沒有降低的話，就有可能是高離子濃度抑制了酶的催化性，或者在濃度不同的環(huán)境下，底物蛋白的存在形式有所改變，導致可催化位點被掩蓋，導致聚合物的相對光密度降低。

圖5 離子強度對TGase催化大豆蛋白11S聚合的SDS-PAGE圖Fig.5 SDS-PAGE profiles of glycinin，after adding TGase

圖6 不同離子強度下聚合物相對光密度圖Fig.6 Relative density of glycinin，after adding TGase at different ionic strength

2.5 pH對TGase催化大豆蛋白11S聚合的影響

一方面大豆蛋白的溶解度受pH影響很大，另一方面TGase的最適pH范圍為5.0～8.0，pH過高活過低都會影響它的活性，因此本實驗的pH條件選為7.1、7.5、8.0、8.5、9.0。圖7為不同pH條件下TGase催化大豆蛋白11S聚合的SDS-PAGE圖，從圖7中可以看到在催化2h后，明顯在15ku左右出現(xiàn)了聚合物，但隨著pH的增加聚合物分子量沒有明顯的變化。從圖8分析來看，相對光密度隨pH的增大先減小后增大，pH在8.0～9.0聚合物含量增加但增加幅度不大，所以可以認為這一范圍是催化的最佳反應條件。在pH為7.5的時候相對光密度最小，這說明在pH7.5時聚合物的含量最少。出現(xiàn)這種情況可能因為pH7.5是該改性物質(zhì)的等電點，在等電點處蛋白質(zhì)的溶解度最小。

圖7 pH對TGase催化大豆蛋白11S聚合的SDS-PAGE圖Fig.7 SDS-PAGE profiles of glycinin，afteadding TGase

圖8 不同pH催化的聚合物相對光密度圖Fig.8 Relative density of glycinin，after adding TGase at different pH

2.6 反應溫度TGase催化大豆蛋白11S聚合的影響

對于酶催化蛋白的反應，溫度的影響應該是重要因素之一。溫度過高無論是底物蛋白還是酶蛋白都會發(fā)生變性沉聚，而溫度低又發(fā)揮不出酶的催化效果。本實驗所使用的TGaes的最適溫度在40～50℃，因此本實驗的溫度條件選取為30、37、40、45、50℃。圖9為不同溫度下催化2h的SDS-PAGE圖譜，從圖9中可以得到聚合物的分子量大約在15ku左右。隨著溫度升高聚合物分子量沒有明顯的變化，說明這一溫度范圍不會明顯改變酶活。從圖10中可以觀察到隨溫度的上升聚合物量增大，但溫度達到45℃時繼續(xù)升高溫度聚合物的量改變不大，所以45℃是其反應的最佳溫度。這是說明TGase酶在這一范圍內(nèi)隨溫度的增高酶活變大，達到最適溫度后繼續(xù)增加溫度對反應的影響不大。

圖9 反應溫度對TGase催化大豆蛋白11S的SDS-PAGE圖譜Fig.9 SDS-PAGE profiles of glycinin，after adding TGase

圖10 反應溫度催化的聚合物相對光密度圖Fig.10 Relative density of glycinin，after adding TGase at different reaction temperature

2.7 改性前后大豆蛋白11S乳化性測定

大豆蛋白的乳化性作用是通過在水-油界面形成一層蛋白質(zhì)膜包裹油滴，從而使油滴均勻分布在水相中。影響乳化穩(wěn)定性的因素有：油滴大小、水-油界面蛋白膜的粘彈性和蛋白質(zhì)顆粒空間結構。由圖11可知改性后大豆蛋白11S的乳化性及乳化穩(wěn)定性均有所提高，改性前乳化性及其穩(wěn)定性分別是30.27%和37.78%，改性后乳化性及其穩(wěn)定性分別是61.15%和79.28%。這是因為酶解改變了大豆蛋白11S結構，使其更易在水-油界面形成蛋白質(zhì)膜，使其乳化性及乳化穩(wěn)定性增加。

圖11 改性前后大豆蛋白11S乳化性及乳化穩(wěn)定性變化圖Fig.11 Comparison of emulsification and its stability on modified and native soybean 11S globulin

3 結論本實驗研究了TGase催化酶解后的大豆蛋白11S聚合的條件。采用堿性蛋白酶酶解大豆蛋白11S，再利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對酶解后的大豆蛋白11S進行聚合，得知改性后大豆蛋白11S聚合物的分子量在15ku左右。加酶量30U/g、離子強度I=0.2、pH8～9.0、反應溫度45℃均有利于TGase對催化大豆蛋白11S交聯(lián)。改性前乳化性及其穩(wěn)定性分別是30.27%和37.78%，改性后乳化性及其穩(wěn)定性分別是61.15%和79.28%。利用TGase催化酶解后的大豆蛋白11S交聯(lián)可以有效改善蛋白質(zhì)的結構及分子量，這種改性所得聚合物在結構和大小方面使其更易在水-油界面形成蛋白質(zhì)膜，因此改性后的蛋白質(zhì)的乳化性及穩(wěn)定性都有了顯著的提高。

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Study on condition of polymerization of 11S globulin by TGase

LIU Ying，XU Jin-li，NAO A-min，ZHENG Zhi-chao，DOU Bo-xin
（College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China）

The conditions of polymerization of 11S globulins by Transglutaminase（TGase）was studied.Firstly，the 11S globulins was hydrolyzed by Alcalase and then polymerized by TGase，the result showed that soybean 11S globulins polymer molecular weight about 15ku.The appropriate enzyme amount for polymerization of 11S was 30U/g，over or below was not good for the reaction.Ionic strength was 0.2，that was beneficial to the formation of polymer.The pH between 8.0～9.0 was better for polymerization.The appropriate temperature was 45℃，that was good for TGase playing a role in polymerzation.Emulsification of native was 30.27%and stability was 37.78%，after modification the emulsification was 61.15%and stability was 79.28%.

soybean 11S globulins；transglutaminase；modification；emulsification and stability

TS201.2

A

1002-0306（2014）08-0180-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.032

2013－07－22

劉穎（1968-），女，博士，教授，研究方向：食品生物技術。

國家高科技研究發(fā)展計劃（863計劃）（2006AA10Z329）。