茯苓菌種液體深層發酵條件優化

唐業剛，胡靄雯

（武漢生物工程學院，湖北武漢430415）

茯苓菌種液體深層發酵條件優化

唐業剛，胡靄雯

（武漢生物工程學院，湖北武漢430415）

采用茯苓9號菌株，通過單因素實驗和正交優化實驗對其液體發酵條件進行優化。結果表明，液體發酵最佳培養基為：葡萄糖30g，酵母浸膏與蛋白胨共10g（添加比例4∶5），KH2PO41g，MgSO40.5g，維生素B17.5mg，水1L。在常溫、150r/min時，菌種最佳液體發酵條件為：培養基初始pH為5.5、培養天數為8d、裝瓶量為70mL/250mL錐形瓶、接種量為7%時，可得到較好菌絲增重量，最大菌絲干重可達5.004g/L。

茯苓，液體發酵，正交優化

茯苓，又名茯菟、不死面、松苓等，屬真菌門，擔子菌亞門，層菌綱，非褶菌目，多孔菌科，茯苓屬[1]，廣泛分布于日本、東南亞、北美洲和澳大利亞及我國云南、福建、安徽等10多個省區。茯苓含有多種營養成分[2]，具有諸如調節免疫功能、抗腫瘤、抗衰老、抗炎等藥理作用[3-4]，茯苓系列保健品如茯苓酸奶、茯苓酒、茯苓果茶等，及茯苓多糖粉、茯苓多糖口服液、桂枝茯苓膠囊等也正在被迅速開發。茯苓傳統固體栽培生產周期長、產量低、受氣候和產地限制，已越來越難以滿足其巨大的市場需求，而液體深層發酵技術則可較好解決上述問題。

目前國內對茯苓液體發酵產物藥用成分，如茯苓多糖等的提取、純化、檢測，及其藥理學作用的研究報道[5-10]較多，但對茯苓液體發酵條件，特別是發酵培養基成分正交優化的實驗報道則不多見。文獻報道多集中于茯苓菌種液體發酵培養條件[5，7，11-12]，如針對溫度、轉速、接種量等進行的單因子實驗研究，對茯苓液體發酵培養基的研究，也大多集中于簡單的碳源、氮源種類及濃度篩選的單因子實驗[5，11，13-14]，對培養基中有機物維生素、無機鹽濃度等成分的報道不多，對于培養基中各成分對發酵效果影響的互作，則罕有文獻[15]報道。本文采用單因子實驗初篩結合正交實驗進一步考查互作的實驗方法，從碳源、氮源、無機鹽及有機物維生素B1等四個方面，對茯苓9號菌種液體發酵培養基成分進行了優化研究，并對發酵培養的起始pH、裝液量、接種量及發酵終點進行了初探，以期為茯苓菌種的大規模液體工廠發酵生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試茯苓9號試管母種菌種 購自華中農業大學大學菌種保藏中心；瓊脂粉 天津科密歐化學試劑開發中心；牛肉浸膏 天津英博生化試劑有限公司；酵母浸粉、蛋白胨 北京奧博星生物技術有限責任公司；維生素B1中國惠興生化試劑有限公司（上海）。

SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化；DHP-9052型電熱恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；202-0B型干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；P270A型普通搖床 武漢中科科儀技術發展有限責任公司；手提式高壓滅菌鍋 上海三申醫療器械有限公司；PHS-25C型數顯酸度計 上海宇隆儀器有限公司；電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 母種擴繁 擴繁培養基成分：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蛋白胨2g、磷酸二氫鉀1g、硫酸鎂0.5g、維生素B110mg、水1.0L，pH自然。將所購試管母種按1∶20比例轉管接種，培養箱中25℃暗培養至菌絲長滿試管，備用。

1.2.2 一級搖瓶種子制備 一級搖瓶配方：葡萄糖20g、酵母浸粉4.0g、蛋白胨5.0g、磷酸二氫鉀1.0g、硫酸鎂0.5g、維生素B110mg、水1.0L，pH自然，以100mL/250mL錐形瓶裝液量分裝，121℃30min滅菌。

接取1.2.1所得擴繁菌絲約2cm長度，并將其分割成多段，接入上述培養基，25℃暗培養，先靜置24h，再于搖床上以150r/min常溫發酵一周，至形成大量均勻致密菌絲球，作為液體搖瓶培養的種子備用。

1.2.3 茯苓液體搖瓶發酵培養基成分的優化

1.2.3.1 碳、氮源種類的篩選 碳源篩選培養基：選擇葡萄糖和蔗糖兩種生產中常見的廉價碳源種類進行實驗，并考查二者的協同作用。分別選取葡萄糖20g、蔗糖20g、葡萄糖10g+蔗糖10g為碳源，培養基其他成分為：酵母浸粉4.0g、蛋白胨5.0g、磷酸二氫鉀1.0g、硫酸鎂0.5g、維生素B110mg、水1.0L，pH自然。

氮源篩選培養基：氮源在液體發酵中起著提供主要營養的重要作用，本實驗對氮源種類進行考查。分別選取蛋白胨9g、酵母浸粉9g、牛肉浸膏9g、尿素9g、蛋白胨5g+酵母浸粉4g為氮源，考查五種氮源種類對發酵效果的影響，培養基其他成分為：葡萄糖20g、磷酸二氫鉀1.0g、硫酸鎂0.5g、維生素B110mg、水1.0L，pH自然。

上述實驗均以100mL/250mL錐形瓶裝液量分裝、121℃30min滅菌，均按10%（mL/mL）接種量接種1.2.2所得一級搖瓶液體種子，于搖床上150r/min常溫搖瓶發酵7d，發酵結束后，紗布過濾發酵物，所得菌絲球50℃烘干至恒重，稱重，計算菌絲球干重（g/L）。

1.2.3.2 碳源、氮源、無機鹽、維生素B1濃度的單因子實驗 a.碳源濃度的單因子實驗：選用1.2.3.1中的最佳碳源種類，設置10、20、30、40、50g五個梯度，培養基其他成分為蛋白胨+酵母浸粉9g（蛋白胨/酵母浸膏＝5/4）、磷酸二氫鉀1g、硫酸鎂0.5g、維生素B110mg，水1.0L。

b.氮源濃度的單因子實驗：基于1.2.3.1中的最佳氮源蛋白胨+酵母浸膏（5∶4），設置6、7、8、9、10g五個梯度，培養基其他成分為葡萄糖20g、磷酸二氫鉀1g、硫酸鎂0.5g、維生素B110mg，水1.0L。

c.KH2PO4/MgSO4濃度（比例固定為2∶1（g/L））單因子實驗：據王偉霞[13]報道，礦物質濃度是茯苓液體發酵的重要影響因素，本實驗對此進行考查，設置2.5/1.25、2.0/1.0、1.5/0.75、1.0/0.5、0.5/0.25五個處理，培養基的其他成分為葡萄糖20g、蛋白胨+酵母浸粉9g（蛋白胨/酵母浸膏＝5/4）、維生素B110mg，水1.0L。

d.維生素B1的單因子實驗（mg/L）：目前少見茯苓液體發酵培養基中VB1添加濃度的報道，本實驗對此進行考查，設置2.5、5.0、7.5、10.0、12.5mg/L五個梯度，培養基其他成分為：葡萄糖20g、蛋白胨+酵母浸粉9g（蛋白胨/酵母浸膏＝5/4）、磷酸二氫鉀1g、硫酸鎂0.5g、水1.0L。

以上實驗的發酵條件均為50mL/250mL錐形瓶裝液量、10%一級搖瓶種子接種量、培養基pH自然，搖床轉速150r/min，常溫，發酵時間為7d。發酵結束后均按1.2.3.1中方法測量菌絲球平均干重并記錄數據。

1.2.3.3 茯苓液體發酵培養基成分的正交優化實驗

根據1.2.3.2各單因子實驗的結果，分別選用液體發酵后菌絲體干重最大的3個水平，進行正交實驗（L9（34））設計（見表1），進行培養基成分的優化實驗。發酵條件同1.2.3.2。

表1 正交實驗的因素與水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test design

1.2.4 茯苓液體菌種培養條件優化 以下實驗液體搖瓶培養基成分均采用1.2.3.3中正交優化后的結果。

1.2.4.1 起始pH單因子實驗 將正交優化培養基的起始pH分別調成4.5、5.0、5.5、6.0、6.5五個水平，在裝液量為100mL/250mL錐形瓶、一級搖瓶種子接種量為10%的條件下，以150r/min在常溫進行搖瓶發酵7d，發酵結束后，稱量菌絲體干重，分析數據，得出培養基的最佳起始pH。

1.2.4.2 茯苓搖瓶時間單因子實驗 正交優化培養基在裝液量為100mL/250mL錐形瓶、接種量為10%、pH自然的條件下，以150r/min在常溫搖瓶發酵，分別在發酵后第4、5、6、7、8、9、10d后結束發酵，稱量菌絲體干重，分析數據，得出最佳搖瓶培養時間。

1.2.4.3 接種裝液量單因子實驗 分別設置40、50、60、70、80、90、100mL/250mL錐形瓶等7種不同水平裝液量配制正交優化培養基，在接種量為10%、pH自然的條件下，以150r/min在常溫搖瓶發酵7d，觀察菌絲生長狀態，并稱量菌絲體干重后分析數據，得出最佳接種裝瓶量。

1.2.4.4 接種量單因子實驗 分別設置4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%等七種不同接種量，將1.2.2所得一級搖瓶種子接種到正交優化培養基中，在裝液量為100mL/250mL錐形瓶、正交優化培養基pH自然的條件下，以150r/min在常溫搖瓶發酵7d，觀察菌絲生長狀態，并稱量菌絲體干重后分析數據，得出最佳接種量。

1.2.4.5 最佳培養條件驗證實驗 選取上述單因子試驗中的最佳起始pH、最佳搖瓶發酵時間、最佳裝瓶量及最佳接種量作為培養條件，進行發酵條件驗證試驗，發酵結束后稱量菌絲球干重，分析數據，得出最佳發酵條件。

1.2.5 數據分析方法 采用鄧肯氏新復極差法（Duncan’s Multiple Range Test）評估每個因素下各水平實驗處理間的差異顯著性（p=0.05）。

2 結果與分析

2.1 茯苓液體菌種發酵培養基成分的優化結果

2.1.1 不同碳源種類對茯苓液體發酵的影響 實驗結果見表2。由表2可知，葡萄糖對茯苓液體發酵菌絲生長的促進效果最佳，菌絲球平均干重極顯著高于另兩種碳源，這與李羿[11]、薛正蓮[5]、付玲等[14]的報道結果相似，這表明，茯苓菌種在液體發酵培養時更容易吸收利用葡萄糖這樣的小分子單糖。還可看出，蔗糖+葡萄糖作為碳源時，其平均菌絲球干重最低，極顯著低于另兩組。這表明，葡萄糖和蔗糖混合使用時兩者可能存在著一定的相互拮抗作用，其具體原因有待進一步研究。

表2 不同碳源對茯苓液體發酵的影響Table 2 Effect of different carbon sources in liquid fermentation of poria

2.1.2 不同氮源種類對茯苓液體發酵的影響結果實驗結果見表3，由表3可知，尿素組平均菌絲球干重僅為0.165g/L，極顯著低于其他組，這表明，茯苓9號菌株液體發酵對無機氮源的利用效率較差，因在搖瓶過程中，有明顯的尿素晶體狀物質析出，故菌絲生長差也有可能是因為尿素濃度添加過高，具體原因有待進一步研究。實驗結果表明，蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨+酵母浸粉對茯苓液體菌種生長都有明顯促進作用，其中，蛋白胨+酵母浸粉組合極顯著高于其他氮源種類。這提示著茯苓9號菌株對動物性氮源（蛋白胨）和微生物源性氮源（酵母浸粉）搭配時的氮源利用效果最佳，極顯著高于二者的單獨利用效率，至于具體的搭配比例是否以5∶4為最佳比例，則有待于進一步深入研究。

2.1.3 碳源、氮源、礦質鹽、維生素B1濃度篩選結果

2.1.3.1 不同碳源濃度對茯苓液體發酵的影響結果實驗結果見表4，由表4可知，隨著葡萄糖濃度的增加，菌絲球干重也大幅度增加，當葡萄糖達到30g/L時，菌絲球干重最大，隨后菌絲球干重開始減少，但減少緩慢。多數學者[5-7]研究認為，以葡萄糖為碳源時，其濃度過高或過低均不利于液體發酵時茯苓菌絲的生長，本實驗結果表明，葡萄糖濃度在30g/L時菌絲球干重達到最大，當葡萄糖濃度大于30g/L時，菌絲球干重逐漸減小，但是變化較為緩慢，這與李羿等[11]的報道結果相似。

2.1.3.2 不同氮源濃度對茯苓液體發酵的影響結果

實驗結果見表5。由表5可知，隨著蛋白胨+酵母浸粉濃度的增加，菌絲球干重也大幅度增加，當蛋白胨+酵母浸粉達到8g/L時，菌絲球干重最大，隨后菌絲球干重開始減少。據李羿等[11]報道，如果茯苓液體發酵時氮源濃度過低，會導致營養不足，明顯不利于菌體生長；但如果氮源濃度過大，則易造成菌體早衰。本實驗亦取得類似結果，當氮源濃度為8g/L時，茯苓液體發酵效果最好，濃度過高或過低均對液體發酵效果有不利影響。

表5 不同氮源濃度對茯苓液體發酵的影響Table 5 Effect of different nitrogen source concentration on liquid fermentation of poria

表7 不同維生素B1濃度對茯苓液體發酵的影響Table 7 Effect of different VB1concentration on liquid fermentation of poria

表3 不同氮源對茯苓液體發酵的影響Table 3 Effect of different nitrogen sources on liquid fermentation of poria

表4 不同碳源濃度對茯苓液體發酵的影響Table 4 Effect of different carbon source concentration on liquid fermentation of poria

表6 不同礦物質濃度對茯苓液體發酵的影響Table 6 Effect of different mineral concentration on liquid fermentation of poria

2.1.3.3 不同礦物質濃度對茯苓液體發酵的影響結果 實驗結果見表6，由表6可知，隨著KH2PO4+MgSO4濃度的增加，菌絲球干重也大幅度增加，當KH2PO4達到1.5g/L、MgSO4達到0.75g/L時，菌絲球干重最大，隨后菌絲球干重開始減少。其原因可能是此礦物質濃度搭配時，能為茯苓菌種液體發酵提供最適滲透壓環境，故菌絲生長最好。

2.1.3.4 不同維生素B1濃度對茯苓液體發酵的影響結果 實驗結果見表7，由表7可知，隨著維生素B1濃度的增加，菌絲球干重也大幅度增加，當維生素B1達到7.5mg時，菌絲球干重最大，隨后菌絲球干重開始減少。目前少有維生素B1對茯苓液體發酵培養效果的單因子實驗報道，甚至有的學者[16]研究的培養基中不添加維生素B1，這可能與茯苓液體發酵培養基培養基中維生素B1所需量的多少與茯苓菌種有著較大關系有關。

表8 茯苓液體發酵培養基成分的L9（34）正交優化實驗結果Table 8 L9（34）orthogonal test results of poria fermentation medium composition

2.1.4 正交優化實驗結果及分析 由表8可知，6號培養基為最優培養基，具有生長優勢，其菌絲球干重最大。由極差R可以看出：優先級是D＞A＞C＞B，即維生素B1＞葡萄糖＞KH2PO4/MgSO4＞蛋白胨+酵母浸粉。由k值可知，最佳組合為A2B3C1D2，即實驗組6號培養基配方，正交分析結果與實驗結果相同，由此確定，6號培養基為最終正交優化結果。

2.2 茯苓液體菌種發酵條件優化的結果

2.2.1 茯苓液體發酵培養基不同起始pH對發酵效果的影響結果 實驗結果見表9，由表9可知，茯苓喜歡偏酸性的發酵環境，當pH為5.5時，茯苓液體發酵生長狀況最佳，菌絲球干重最大可達2.849g/L，實驗結果符合茯苓確屬喜酸性食用菌菌種的生物學特征。

2.2.2 不同培養時間對茯苓液體發酵的影響結果 實驗結果見表10，由表10可知，隨著發酵時間的增加，茯苓菌絲球干重逐步遞增，當發酵培養時間為8d時，菌絲球干重最大，可達2.228g/L，隨后開始減少。這個結果與很多文獻[11，13，16]報道的最佳發酵時間為5～6d有所出入，其原因可能是本文采用的是100mL的裝液量，較文獻中所述的50mL生長要緩慢，故所需培養時間相對要長一些有關。

表9 培養基不同起始pH對茯苓液體發酵的影響Table 9 Effect of initial pH value of medium on liquid fermentation of Poria

2.2.3 不同裝液量對茯苓液體發酵的影響結果 實驗結果見表11，由表11可知，當裝瓶量為70mL時，茯苓生長狀況最佳，菌絲球干重最大可達3.906g/L。這與大部分文獻[6，12，16]報道的最佳裝液量為60mL/250mL稍有差異，其原因可能與本實驗所采用的接種量為10%，而文獻中一般為5%的接種量有關。

表10 不同發酵培養時間對茯苓液體發酵的影響Table 10 Effect of different fermentation culture time on liquid fermentation of poria

表11 不同裝液量對茯苓液體發酵的影響Table 11 Effect of the different volume of the liquid on liquid fermentation of poria

2.2.4 不同接種量對茯苓液體發酵的影響結果 實驗結果見表12，由表12可知，接種量為7%時，茯苓菌種液體發酵生長狀況最佳，菌絲球干重最大可達4.786g/L。這與大部分文獻[11-12，16]報道的最佳接種量為6%略有差異，其原因可能與本實驗所采用的裝液量為100mL/mL，而文獻中一般為50mL/mL的裝液量有關。2.2.5 最佳培養條件驗證實驗結果 當綜合采用2.2.1～2.2.4各單因子實驗的最佳培養條件，即搖瓶培養基起始pH為5.5、裝瓶量為70mL/250mL、接種量為7%，發酵培養時間為8d時，所得菌絲球平均干重為（5.004±0.241）g/L，五個重復數據中除了一個數據略低于2.1.1～2.2.4各試驗結果的最高值4.786g/L外，其余數據均高于此值，這顯示上述驗證實驗的培養條件即為最佳培養條件。至于上述驗證實驗的四個培養條件對搖瓶發酵結果的互作研究，則有待于進一步正交試驗設計進行深入研究。

Optimization of poria liquid fermentation condition

TANG Ye-gang，HU Ai-wen
（Wuhan Bioengineering Institute，Wuhan 430415，China）

Liquid fermentation optimal condition of poria No.9 was studied in this paper by designing single factor experiments and optimization of orthogonal experiment.The results showed that the optimum fermentation medium includes glucose 30g，yeast extract and peptone 10g（the ratio was 4∶5），KH2PO41g，MgSO40.5g，VB17.5mg in the water of 1L.The optimum cultivation conditions in the temperature of 25℃，rotation speed 150r/min were as follow：rinitial pH5.5，cultivation time 8d，liquid strain quantity of inoculation 7%，70mL medium/250mL erlenraeyer，and the maximum mycelial dry weight could reach 5.004g/L.

poria；liquid fermentation；orthogonal designing

TS201.7

A

1002-0306（2014）08-0214-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.040

2013－08－19

唐業剛（1979-），男，碩士研究生，講師，研究方向：食用菌液體發酵及金屬富集。