微波固相合成L-瓜氨酸鋅螯合物的研究

劉 玲，馮 振，燕 南，牟 杰，劉 毅，鄭友廣，安 琳，張榮麗

（1.徐州醫學院藥學院，江蘇徐州221004；

2.徐州醫學院公共教育學院，江蘇徐州221004）

微波固相合成L-瓜氨酸鋅螯合物的研究

劉 玲1，馮 振1，燕 南1，牟 杰1，劉 毅1，鄭友廣1，安 琳1，張榮麗2，*

（1.徐州醫學院藥學院，江蘇徐州221004；

2.徐州醫學院公共教育學院，江蘇徐州221004）

以L-瓜氨酸和乙酸鋅為原料，在固體狀態下，通過微波輻射合成L-瓜氨酸鋅螯合物。以螯合率為指標，運用單因素和正交實驗對影響L-瓜氨酸鋅螯合物的合成條件進行了研究，得出最佳反應條件為：碳酸鈉添加量15%，微波輻射功率300W，微波輻射時間4min，水分添加量5%；在此工藝條件下，L-瓜氨酸鋅螯合物的平均螯合率達到91.1%；紅外光譜初步確證了化合物的螯合結構。

L-瓜氨酸鋅螯合物，微波，固相合成

氨基酸微量元素配合物具有良好的生物化學穩定性，易被人體吸收，利用率高，無毒副作用，是近年來發展較快的一類新型營養添加劑。L-瓜氨酸是一種首先從西瓜汁中發現的人體內非蛋白質氨基酸，研究表明，瓜氨酸具有重要生理功能，能夠清除自由基、抗氧化、舒張血管等，在醫藥、食品、保健等各個領域廣泛應用[1-2]。鋅是已知的人體14種必需微量元素之一，由于其在人體內廣泛的生理生化作用而被稱為“生命元素”[3]。瓜氨酸鋅螯合物既能補充人體所必需的微量元素鋅又能提供生理活性物質瓜氨酸，并且吸收比單獨的補鋅制劑好。因此，對L-瓜氨酸鋅螯合物合成工藝的研究有著重大意義。

目前，氨基酸金屬螯合物合成多采用水相合成法，但該方法存在合成工藝長，三廢多，純化困難，成本高等缺點[4]；而微波輻射技術與傳統的加熱方法相比，具有反應速度快、產率高及產品易純化等優點[5]。本實驗以L-瓜氨酸與乙酸鋅為原料，通過微波輻射固相合成L-瓜氨酸鋅螯合物，并探討了合成最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L-瓜氨酸 寧波市鎮海海德生化科技有限公司；乙酸鋅 江蘇徐州化學工業二廠；二甲酚橙 天津市化學制劑研究所；乙二胺四乙酸 上海凌峰化學試劑有限公司。

MAS-Ⅱ型微波爐 新儀微波化學科技有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環水式真空泵 天津市天發科技有限公司；島津IR-750型紅外光譜儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 瓜氨酸鋅螯合物的合成 將L-瓜氨酸和乙酸鋅以2∶1的摩爾比混合，加入一定量的碳酸鈉充分研勻，加適量水作反應引發劑，放至微波爐以不同功率進行反應。用蒸餾水充分洗滌并干燥稱重。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 加堿量的確定 將L-瓜氨酸和乙酸鋅以2∶1的摩爾比混合，添加水分5%混勻，分別添加碳酸鈉10%、15%、20%、25%、30%，放置微波爐加熱，微波功率400W，微波輻射時間4min，重復實驗三次，通過比較螯合率來確定合適的碳酸鈉添加量。

1.2.2.2 微波輸出功率的確定 將L-瓜氨酸和乙酸鋅以2∶1的摩爾比混合，添加碳酸鈉20%和水分5%后混勻，放置微波爐加熱，微波功率分別為100、200、300、400、500W，微波輻射時間4min，重復實驗三次，通過比較螯合率來確定合適微波輸出功率。

1.2.2.3 微波輻射時間的確定 將L-瓜氨酸和乙酸鋅以2∶1的摩爾比混合，添加碳酸鈉20%和水分5%后混勻，放置微波爐加熱，微波功率為400W，微波輻射時間分別為2、3、4、5、6min，重復實驗三次，通過比較螯合率來確定合適微波輻射時間。

1.2.2.4 水分添加量的確定 將L-瓜氨酸和乙酸鋅以2∶1的摩爾比混合，添加碳酸鈉20%，分別向其中加入水分2%、3%、4%、5%、6%后混勻，放置微波爐加熱，微波功率400W，微波輻射時間4min，重復實驗三次，通過比較螯合率來確定合適的引發劑添加量。

1.2.3 正交實驗 在單因素實驗基礎上，將L-瓜氨酸和乙酸鋅以2∶1的摩爾比混合，選取加堿量（A）、微波功率（B）、微波時間（C），水分添加量（D）四個因素，采用L9（34）正交實驗設計。以螯合率為指標．確定最佳合成條件，因素水平設計見表1。

表1 L9（34）實驗因素水平表Table 1 L9（34）Orthogonal factor level table

1.2.4 微量元素螯合率的測定 取制得的瓜氨酸鋅0.01g，加20mL水，滴加1mol/L的HCl溶液至完全溶解，用2mol/L的NaOH溶液調節pH到5～6之間。加6mL HAc-NaAc緩沖溶液（pH=5.5）和1～2滴0.5%二甲酚橙指示劑至溶液呈鮮紅色。立即用0.01mol/L的EDTA標準滴定溶液滴定至溶液由紅色突變為亮黃色，記錄下所用EDTA溶液的體積并計算螯合率。

螯合態Zn元素的摩爾質量=CV×10-3×m/0.01；反應前Zn元素的摩爾質量=M/183.47；

螯合率（%）=（螯合態Zn元素的摩爾質量/反應前Zn元素的摩爾質量）×100

式中，C—EDTA的濃度，為0.01mol/L；V—滴定所用EDTA的體積，mL；m—反應后所得瓜氨酸鋅螯合物的質量，g；M—反應前使用原料乙酸鋅的質量，g；其中，乙酸鋅分子量為183.47。

1.2.3 紅外光譜的測定 紅外光譜：以KBr壓片法，在4000～400cm-1范圍內測定瓜氨酸和瓜氨酸鋅的紅外圖譜。

2 結果與討論

2.1 L-瓜氨酸與乙酸鋅的摩爾配比的確定

氨基酸與金屬離子的摩爾配比是影響合成的關鍵因素，如果太小，所得螯合物不穩定；如果過大，螯合物穩定性過高，影響其生物利用度，此外，還會浪費原料。因此，本實驗根據文獻[6-7]報道的氨基酸與鋅離子的配位可能結構（如圖1）采用L-瓜氨酸與乙酸鋅的摩爾配比為2∶1進行實驗，既能保證螯合物結構的相對穩定，又能充分利用L-瓜氨酸。

圖1 L-瓜氨酸鋅螯合物的分子結構式Fig.1 The structure of L-citrulline chelated zinc

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 加堿量對螯合反應的影響 采用乙酸鋅為原料時，反應副產物是乙酸，具有較高的偶極極化率，如不盡快除去，將造成反應物局部受熱過大，引起產物的焦糊、分解。碳酸鈉能迅速中和反應過程中產生的副產物酸，調節反應體系的酸堿度，促進反應向正方向進行。作為脫酸劑，它對瓜氨酸鋅螯合物的穩定性不產生負面影響，且易于洗滌除去，不影響產物的提取。從實驗結果可以看出（圖2），隨著加堿量的提高，反應螯合率逐漸增加，當添加量為20%時，螯合率達到最大值。繼續提高加堿量，反應的螯合率反而下降，這是由于堿性物質的過量加入，在一定程度降低了L-瓜氨酸與乙酸鋅之間的接觸程度。

圖2 加堿量對螯合率的影響Fig.2 Effect of sodium carbonate addition on the chelation ratio

圖3 微波輸出功率對螯合率的影響Fig.3 Effect of microwave power on the chelation ratio

2.2.2 微波輸出功率對螯合反應的影響 微波不同于一般的常規加熱，后者一般是由外部熱源通過熱輻射由表及里的傳導式加熱，而微波是一種電磁波，具有一定的穿透能力，能對物體進行體內加熱。通過提高微波功率可以加強微波的穿透強度，加速反應的進行。結果顯示（圖3）：微波輸出功率對反應的螯合率影響顯著。隨著微波輸出功率的增加，瓜氨酸鋅的螯合率也大幅度提高。當微波輸出功率為400W時，反應的螯合率達到最大值。但當功率達到能為反應提供足夠的能量后，繼續增大功率，螯合率快速下降，原因是過高的能量產生瞬時高溫，引起產物焦糊，同時副反應增多，引起螯合率下降。

2.2.3 微波輻射時間對螯合反應的影響 微波輻射時間對螯合反應的影響見圖4。微波輻射時間低于3min時，反應螯合率低于65%；隨著輻射時間的延長，螯合率逐漸升高，在4min左右達到最高值；但微波輻射超過4min，螯合率呈現下降趨勢，因此，本反應的最佳輻射時間為4min。

圖4 微波輻射時間對螯合率的影響Fig.4 Effect of microwave irradiation time on the chelation ratio

2.2.4 水分添加量對螯合反應的影響 一般物質對微波吸收能力主要是由介電常數和介質損耗角正切來決定的[8]。在固相反應中，適當添加介電常數較大的水分子，能更好地吸收微波，促進反應發生。理論上，引發劑量主要影響初始反應速度，并不影響反應進行的程度[9]，故實驗中最佳引發劑水分添加量為5%（見圖5）。

圖5 引發劑水分的添加量對螯合率的影響Fig.5 Effect of water addition on the chelation ratio

2.3 正交實驗結果

按L9（34）進行正交實驗，結果見表2，方差分析見表3。各因素對L-瓜氨酸鋅螯合率的影響程度大小順序為：微波輻射時間＞水分添加量＞微波輻射功率＞加堿量。L-瓜氨酸鋅螯合物的最佳合成條件為A1B1C2D2，即碳酸鈉添加量為15%，微波輻射功率為300W，微波輻射功率為4min，水分添加量為5%。進行三次驗證實驗，得到螯合率分別為90.2%、91.3%、91.9%，其平均值為91.1%，說明選定條件是穩定的，并且重現性好。

表2 正交實驗結果Table 2 Reslult of orthogonal experiment

表3 方差分析結果Table 3 Analysis of variance

圖6 L-瓜b氨酸及L-瓜氨酸鋅螯合物的紅外圖譜Fig.6 IR spectra of L-citrulline and L-citrulline chelated zinc

2.4 產品紅外光譜分析

由圖6可知，L-瓜氨酸在3361cm-1有由氨基（-NH2）的伸縮振動引起的特征吸收，以及由羰基（-C=O）在1674cm-1伸縮振動引起的特征吸收。當L-瓜氨酸與鋅螯合后，氨基的吸收峰移至3398cm-1處；而羰基的吸收值大大增強，特征吸收移至1654cm-1，這是由于瓜氨酸的氨基和羧基氧參與配位形成螫合物的結果。同時，在500cm-1附近沒有出現配位水分子的面內和面外搖擺振動峰γ（H2O）和ω（H2O），說明產物中沒有配位水分子的存在[10]。螯合物生成后，在2113cm-1處α-氨基酸的特征吸收峰消失，與文獻報道結果一致[11]。

其中，L-瓜氨酸鋅螯合物的紅外數據如下：IR（KBr，cm-1）：3398、3338、3282、3190、2954、2935、2877、1654、1629、1581、1556、1398、1334、1160、1124、1101、644、580。

3 結論

本研究通過微波固相法合成得到L-瓜氨酸鋅螯合物，通過紅外光譜進行結構分析，初步確證了化合物結構；進一步對化合物合成進行單因素和正交實驗分析，確定了L-瓜氨酸鋅螯合物的最佳合成條件：碳酸鈉添加量15%，微波輻射功率300W，微波輻射功率4min，水分添加量5%，所得L-瓜氨酸鋅螯合物平均螯合率為91.1%。

[1]Sureda A，Cordova A，Ferrer MD，et al.Effects of L-citrulline oral supplementation on Polymorphonuckar neutrophils oxidative burst and nitric oxide production after exercise[J].Free Radic Res，2009，43（9）：828.

[2]劉娟，路欣欣，孟慧.瓜氨酸的藥理作用及生產方法的研究進展[J].藥學實踐雜志，2011，29（3）：173-175.

[3]Salgueim MJ，Zubillaga M，Lysionek A，et al.Zinc as all essential mieronutrient：A review[J].Nutr Res，2000，20（5）：737-755.

[4]李致寶，粱初海，韋少平，等.有機鋅的合成研究進展[J].化工技術與開發，2012，41（3）：21-22.

[5]Lidstr?m P，Tierney J，Wathey B，et al.Microwave assisted organic synthesis-a review[J].Tetrahedron，2001，57（45）：9225-9283.

[6]楊云裳，薛愛愛，張應鵬，等.L-天門冬氨基酸鋅螯合物的合成研究[J].食品工業科技，2008，29（2）：250-251.

[7]Kurtz AC.A simple synthesis of dl-citrulline[J].J Biol Chem，1938，122：477-484.

[8]劉鐘棟.微波技術在食品工業中的應用[M].北京：中國輕工業出版社，1998：26-29.

[9]賈殿贈，楊立新，夏熙，等.微波技術在固相配位化學反應中的應用研究[J].高等學校化學學報，1997，18（9）：1432-1435.

[10]候育冬，高勝利，郭利娟，等.硫酸鋅與L-α-氨基酸配合行為的相化學研究[J].高等學校化學學報，1999，20（9）：1346-1348.

[11]黃漢良，凌靈.蛋氨酸鋅的合成研究[J].化工技術與開發，2007，36（10）：15-17.

Study on the synthesis of L-citrulline chelated zinc by microwave in solid state

LIU Ling1，FENG Zhen1，YAN Nan1，MOU Jie1，LIU Yi1，ZHENG You-guang1，AN Lin1，ZHANG Rong-li2，*
（1.The school of Pharamcy，Xuzhou Medical College，Xuzhou 221004，China；2.The School of Basic Education Sciences，Xuzhou Medical College，Xuzhou 221004，China）

The L-citrulline chelated zinc was synthesized with L-citrulline and zinc acetate as reactants in solid state by microwave.To determine the chelation ratio by single factor and orthogonal experiment，we get the best conditions of reaction：sodium carbonate 15%，microwave power 300W，microwave irradiation time 4min，water 5%.Under the optimal conditions，the average yield of L-citrulline chelated zinc was 91.1%.Meanwhile，the structure of the product was preliminarily confirmed by IR spectrometry.

L-citrulline chelated zinc；microwave；solid state reaction

TS201.2

B

1002-0306（2014）08-0283-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.055

2013－08－02 *通訊聯系人

劉玲（1982-），女，碩士研究生，講師，研究方向：新藥設計與藥物合成。

徐州市科技計劃項目（XF11C065，XZZD1153）；江蘇省腦病重點實驗室開放課題（Jsbl1104）；江蘇省大學生創新訓練計劃項目（2012JSSPITP1846）；江蘇省高校自然科學基金項目（10JKB350005）。