正交實驗優化川明參多糖超聲提取工藝

董紅敏，李素清，牛小勇，沈麗雯，李 路，秦 文，*

（1.四川農業大學食品學院，四川雅安625014；2.閬中縣供銷合作社，四川閬中637400）

正交實驗優化川明參多糖超聲提取工藝

董紅敏1，李素清1，牛小勇2，沈麗雯1，李 路1，秦 文1，*

（1.四川農業大學食品學院，四川雅安625014；2.閬中縣供銷合作社，四川閬中637400）

研究超聲波水提醇沉法提取川明參多糖的最佳工藝。通過單因素實驗和正交實驗對提取工藝進行優化設計，采用苯酚-硫酸比色法測定多糖含量，考察料液比、超聲提取溫度、超聲功率、超聲作用時間和超聲提取次數對川明參多糖提取率的影響。得出影響川明參多糖提取率的先后次序為：料液比＞超聲提取溫度＞超聲功率＞超聲作用時間。最佳提取工藝條件為溫度70℃，超聲功率140W，料液比1∶40，提取時間45min，提取2次。該工藝條件下，川明參多糖的平均提取率為47.13%。

川明參，超聲提取，多糖，正交實驗

川明參是傘形科（Umbelliferae）植物川明參屬“chuanminshen violaceum Sheh et Shan”的干燥根，又名明參、明沙參、土明參、沙參，是我國特有的單種屬植物，是四川產道地藥材。具有滋陰補肺，健脾等功效，主治熱病傷陰，肺熱咳嗽，脾虛食少，病后體弱[1-2]。川明參中含有多糖、香豆素、黃酮、甾醇、蛋白質和氨基酸、有機酸、酚類等化學成分[3]。其中多糖含量最高。已有的研究表明川明參多糖具有抗突變作用，鎮咳、祛痰，免疫調節作用，抗疲勞、抗氧化作用以及抗病毒作用等[4-7]，可廣泛應用于醫藥和保健食品領域，市場前景廣闊，因此高效提取川明參多糖具有重要意義。

目前，對川明參多糖提取的研究，主要采用熱水浸提法或熱回流法[8-9]，這些方法具有能耗大，效率低，提取溫度高，容易造成多糖降解，多糖活性降低等缺點。而超聲波提取由于具有簡單、方便、快速、得率高且不影響有效成分等優點，近年來被廣泛應用到植物活性成分的提取中[10]。而有關川明參多糖超聲提取的研究尚未有報道。

本實驗采用超聲波法提取川明參多糖，用苯酚-硫酸比色法對川明參多糖進行含量測定，詳細研究并優化了超聲波法提取川明參多糖的工藝條件，為川明參多糖提取的工業化應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮川明參 2013年春由四川閬中供銷社提供；葡萄糖、石油醚、無水乙醇、濃硫酸、苯酚 均為分析純，成都市科龍化工試劑廠。

FW177型中藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；KQ5200DB型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；UV-3200型掃描型紫外可見分光光度計 上海美普達儀器有限公司；SC-04型低速離心

1.2.3 單因素實驗 以蒸餾水為提取劑，分別就料液比、超聲溫度、超聲功率、超聲作用時間和超聲次數做單因素實驗。

1.2.3.1 料液比 固定超聲溫度50℃，超聲功率80W，超聲作用時間15min，超聲次數2次，考察不同料液比（g/mL）1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50對川明參多糖提取率的影響。

1.2.3.2 超聲溫度 固定超聲功率80W，超聲作用時機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；101-4型恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；Heto Power Dry PL3000型凍干機 美國Thermo Scientific公司；電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 川明參多糖超聲波水提醇沉工藝流程 新鮮川明參→干燥→粉碎→過篩→脫脂、脫色、除小分子糖→干燥→超聲提取→過濾→濃縮→醇沉過夜→離心→沉淀復溶→除蛋白質→醇沉→離心、洗滌沉淀→真空冷凍干燥→粗多糖。

將新鮮川明參清洗除去泥土等雜質，置于鼓風干燥箱中，60℃，干燥，至恒重，粉碎，過80目篩，石油醚：95%乙醇（V∶V）1∶1回流脫脂、脫色和除去小分子糖[11]，濾渣60℃干燥，密封保存備用。

1.2.2 川明參多糖含量測定 采用苯酚-硫酸比色法測定[12]。

1.2.2.1 標準曲線的繪制 精密稱取105℃烘干至恒重的標準葡萄糖對照品0.1g（精確到0.0001g），加蒸餾水溶解并定容于100mL容量瓶中，得到1mg/mL的標準溶液，分別精密吸取2、4、6、8、10mL于100mL容量瓶中定容得到20、40、60、80、100μg/mL的葡萄糖標準溶液。分別移取上述葡萄糖標準溶液2mL，置于具塞試管中，各加質量分數為5%的苯酚溶液1mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0mL，搖勻后室溫放置5min，置沸水浴中加熱15min，迅速冷卻至室溫，另以蒸餾水2mL加苯酚和濃硫酸，同上操作為空白對照[13]。采用掃描型紫外可見分光光度計在300～800nm范圍內掃描，在最大吸收波長處測定吸光度。以葡萄糖質量濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制吸光度-葡萄糖質量濃度的關系曲線。

1.2.2.2 供試品溶液的制備 采用水提醇沉法制備粗多糖，醇沉方法參考張梅等[14]，并有所改動。稱取適量預處理后的川明參粉，用蒸餾水按一定的料液比（川明參粉∶蒸餾水，g/mL）、超聲提取溫度、超聲功率、超聲作用時間及提取次數超聲提取，趁熱減壓抽濾，濾液濃縮至10～15mL，加無水乙醇至體積分數為80%沉淀多糖，靜置過夜，離心，沉淀部分用蒸餾水溶解，稀釋一定倍數得川明參多糖待測液。

1.2.2.3 川明參多糖含量的測定 準確移取2mL一定稀釋倍數的川明參多糖待測液，按照1.2.2.1的操作方法加入苯酚和濃硫酸，以蒸餾水代替樣品作為空白，于489nm處測定吸光度值，平行測定三次，計算川明參多糖提取率。間15min，超聲次數2次，采用以上選出的結果，考察超聲溫度30、40、50、60、70、80℃對川明參多糖提取率的影響。

1.2.3.3 超聲功率 固定超聲作用時間15min，超聲次數2次，采用以上選出的結果，考察超聲功率80、100、120、140、160、180W對川明參多糖提取率的影響。

1.2.3.4 超聲時間 固定超聲次數2次，其他條件采用以上選出的結果，考察提取時間15、30、45、60min對川明參多糖提取率的影響。

1.2.3.5 超聲次數 采用以上選出的結果為固定條件，提取4次，測定每一次川明參多糖的提取率。

1.2.4 川明參多糖超聲提取的正交實驗設計 在單因素實驗的基礎上，采用四因素三水平，按L9（34）正交設計[15]進行川明參多糖超聲提取正交實驗，各因素及水平設計如表1所示，每組實驗重復3次。

表1 L9（34）正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of the L9（34）orthogonal design

1.2.5 超聲提取法與常規提取法的比較 分別對超聲提取法、常溫浸漬法、熱浸提法進行川明參多糖的提取率的測定，比較三者的優劣。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

按1.2.2.1方法，經掃描后得到波長489nm為最大吸收波長，即489nm為測定波長。以葡萄糖質量濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制吸光度-葡萄糖質量濃度的關系曲線，得到標準曲線方程：y=0.0133x+0.0127，r=0.9992。結果表明，葡萄糖標準溶液的質量濃度在20～100μg/mL范圍內與吸光度具有良好的線性關系。

圖1 料液比對川明參多糖提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of polysaccharides from chuanminshen violaceum

2.2 單因素實驗

2.2.1 料液比對川明參多糖提取率的影響 實驗結果如圖1所示，在料液比1∶10～1∶40時，川明參多糖提取率增加，并由增長緩慢到逐漸加快，這是因為在傳質過程中，隨著提取劑的增加，溶液中多糖濃度逐漸稀釋，增加了固相與液相間多糖的濃度差，加快了傳遞速度，當料液比達到1∶40時，提取率達到最大，但料液比1∶50時提取率明顯下降，可能是因為料液比過大，增加了超聲波破碎細胞的阻力，使細胞破碎程度下降，從而降低了多糖的提取率[16]，也有可能是其他雜質溶出抑制了多糖的溶出。此外，隨著蒸餾水量的增加，提取液濃縮的難度加大，濃縮時間過長也會影響多糖的提取率。因此，綜合各因素，選擇最佳料液比為1∶40。

2.2.2 超聲溫度對川明參多糖提取率的影響 實驗結果如圖2所示，超聲溫度低于70℃時，提取溫度越高，川明參多糖的提取率越高，這是因為低溫時，超聲波未能使細胞徹底破碎，而隨著溫度的增加，分子的熱運動加速，進一步破壞了細胞結構，從而使多糖充分釋放；溫度高于70℃后，多糖的提取率下降，這是因為高溫和超聲波破碎的協同作用導致部分川明參多糖破壞和降解，影響了川明參多糖的提取率[17-18]。因此，川明參多糖的超聲提取溫度不宜超過70℃。

圖2 超聲溫度對川明參多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction yield of polysaccharides from chuanminshen violaceum

2.2.3 超聲功率對川明參多糖提取率的影響 實驗結果如圖3所示，在超聲功率80～140W時，隨著功率的增大，川明參多糖的提取率逐漸增加，超聲波功率為140W時，提取率達到最大值，當功率超過140W時，多糖提取率逐漸降低。這可能是因為超聲時間固定，超聲波的破碎作用主要取決于超聲波的功率，功率越大，超聲波對細胞的破碎作用越強，但當超聲功率大于一定程度時，提取液的流動加速，減少了物料在超聲場中的停留時間，細胞破碎作用也就隨之減弱[16]。另外，高功率作用可能會導致多糖分子糖苷鍵的斷裂，從而影響多糖提取率。因此超聲功率以140W為宜。

2.2.4 超聲時間對川明參多糖提取率的影響 實驗結果如圖4所示，在10～45min時，多糖的提取率隨著超聲時間的增加而明顯提高，45min時川明參多糖提取率最高，隨著時間的繼續延長，多糖提取率呈下降趨勢。這可能是因為隨著時間的增加，川明參細胞破碎度逐漸增大，多糖溶出量逐漸增加，提取率提高；時間過長，細胞進一步破碎，雜質的溶出相應增多，川明參多糖的提取率隨之降低，而且超聲波具有較強的機械剪切作用，長時間作用會使大分子的多糖斷裂，影響多糖的提取率[18]。因此超聲波作用時間以45min為宜。

圖3 超聲功率對川明參多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of polysaccharides from chuanminshen violaceum

圖4 超聲作用時間對川明參多糖提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of polysaccharides from chuanminshen violaceum

2.2.5 超聲次數對川明參多糖提取率的影響 實驗結果如圖5所示，超聲提取兩次已達到基本提取完全，所以從經濟合理性考慮，選取超聲提取2次為最佳提取次數。

圖5 超聲次數對川明參多糖提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic action times on the extraction yield of polysaccharides from chuanminshen violaceum

2.3 正交實驗

在單因素實驗的基礎上，選取超聲溫度（A），超聲功率（B），料液比（C），超聲時間（D）4個因素作為考察指標。采用L9（34）正交實驗設計，提取次數固定為2次，進行優化川明參多糖的提取工藝條件，正交實驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 正交實驗設計與結果分析Table 2 Trials and results of orthogonal experiment

表3 方差分析表Table 3 Analysis results of variance

由表2中R值可知，影響川明參多糖提取率的先后順序是：料液比＞超聲提取溫度＞超聲功率＞超聲作用時間。由表3方差分析結果可知，超聲提取溫度、超聲功率、料液比對提取率的影響極為顯著，超聲作用時間對提取率的影響不顯著。由k值大小可知，優化工藝組合為A2B2C2D2，此結果與單因素實驗篩選出的最佳條件組合一致，而正交實驗提取率最高組合為A2B3C1D2，又因超聲功率和料液比對提取率的影響極為顯著，故將兩組合分別進行驗證實驗，實驗結果見表4。

表4 驗證實驗結果（n=3）Table 4 Results of verification experiment（n=3）

由表4驗證實驗結果可知，川明參多糖超聲提取的最佳工藝組合為A2B2C2D2，即超聲溫度70℃，超聲功率140W，料液比1∶40，超聲作用時間45min，提取2次，得到川明參多糖提取率為最高值47.13%，RSD為0.11%。

2.4 超聲提取法與常規提取法的比較

準確稱取一定量預處理后的川明參粉，固定提取溫度70℃（常溫浸漬法除外），料液比1∶40，提取次數2次，相對延長熱浸提和常溫浸漬法的提取時間，測定三種提取方法川明參多糖的提取率，實驗條件及結果見表5。

表5 超聲提取與常規提取法的比較Table 5 Comparison of three extraction methods

由表5可知，超聲提取法較常規提取法有較大優勢，不僅明顯提高了多糖的提取率，而且大大縮短了提取時間，有利于工業化生產。

3 結論

本實驗通過單因素實驗和正交實驗，采用超聲法提取了川明參多糖。實驗結果表明，影響超聲提取川明參多糖提取率的四個因素中超聲提取溫度、超聲功率、料液比對提取率的影響極為顯著，超聲作用時間對提取率的影響不顯著，其先后順序為：料液比＞超聲提取溫度＞超聲功率＞超聲作用時間。綜合考慮各因素得到的優化工藝參數為：超聲溫度70℃，超聲功率140W，料液比1∶40，超聲作用時間45min，提取2次。在該條件下川明參多糖的提取率是47.13%。與常規水提法相比，超聲法安全、簡單易行、效率高，是一種提取川明參多糖的有效途徑。

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Optimizing ultrasonic extraction of plysaccharides from Chuanminshen violaceum based on orthogonal experiments design

DONG Hong-min1，LI Su-qing1，NIU Xiao-yong2，SHEN Li-wen1，LI Lu1，QIN Wen1，*
（1.College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China；2.Langzhong Supply and Marketing Cooperative，Langzhong 637400，China）

In order to obtain optimization of ultrasonic extraction of polysaccharides from Chuanminshen violaceum，the effect of the solid-liquid ratio，extraction temperature，ultrasonic power，ultrasonic action time and the extraction times of the polysaccharides by single factor experiments and orthogonal experiments in distilled water were investigated.The content of polysaccharides was determined by phenol-vitriol colorimetry method. The decreasing order of importance of the four process conditions affecting polysaccharide extraction was solid-liquid ratio，extraction temperature，ultrasonic power and ultrasonic action time.The orthogonal experimental results showed that the optimal conditions were extraction temperature 70℃，ultrasonic power 140W，solidliquid ratio 1∶40，ultrasonic action time 45min，2 times.Under this condition，the average rate of extraction of polysaccharides was 47.13%.

Chuanminshen violaceum，ultrasonic extraction，polysaccharides，orthogonal experiments design

TS201.1

B

1002-0306（2014）08-0306-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.061

2013－08－28 *通訊聯系人

董紅敏（1989-），女，碩士研究生，研究方向：農產品產后處理與品質控制。