以STAT3為靶標的抗腫瘤藥物高通量篩選模型的建立和應(yīng)用

潘麗 張寧 牛國君 孟晶 劉祥 楊誠

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.南開大學(xué)藥學(xué)院，天津 300071；3.天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，天津 300457；4.南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300071）

以STAT3為靶標的抗腫瘤藥物高通量篩選模型的建立和應(yīng)用

潘麗 張寧 牛國君 孟晶 劉祥 楊誠

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.南開大學(xué)藥學(xué)院，天津 300071；3.天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，天津 300457；4.南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300071）

旨在建立穩(wěn)定可靠的以轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子（STAT3）為靶標的抗腫瘤高通量篩選模型，應(yīng)用該模型篩選潛在的抗癌藥物。利用基因重組、蛋白表達純化技術(shù)，獲得STAT3目的蛋白，使用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）進行高通量藥物篩選，將篩選出的抑制劑在細胞水平上利用MTT比色法測定化合物對癌細胞增殖的影響。結(jié)果顯示，成功構(gòu)建表達載體pET-28a-STAT3；所建立的模型穩(wěn)定可行，可用于以STAT3為靶標的抗腫瘤藥物的高通量篩選；用該模型對8 248個樣品進行篩選，在500 μmol/L藥物濃度下，化合物MDC6抑制率為92%，另外，進行IC50值的測定時，分子水平上最低達到3.37 μmol/L，在細胞水平上可達到15.92 μmol/L。建立的高通量藥物篩選模型，具有操作方便、成本低、結(jié)果穩(wěn)定等特點，可用于STAT3抑制劑的大規(guī)模篩選。

STAT3 靶點 高通量模型 ELISA

STAT3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3）為STAT家族中的一員，是細胞因子及生長因子受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)器和轉(zhuǎn)錄激活器，其發(fā)揮的主要功能是將細胞質(zhì)內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細胞核內(nèi)，并與可調(diào)節(jié)重要生化過程的特異性DNA啟動子序列結(jié)合，調(diào)控這些基因的表達［1］。

STAT3在機體內(nèi)多種細胞和組織中都有表達，對正常細胞的生存、增殖、分化、凋亡均具有重要

的調(diào)節(jié)作用。正常生理狀態(tài)下，STAT3的活化快速、短暫且被精確調(diào)控，而在多種腫瘤細胞，如肺癌、乳腺癌［2］、惡性黑色素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤［3］、前列腺癌、卵巢癌、腦瘤、結(jié)腸癌［4］和各種白血病中，均發(fā)現(xiàn)由于失去對STAT3的精確調(diào)控，導(dǎo)致STAT3在這些腫瘤細胞中得到高表達［5］，并被持續(xù)性激活，因而不斷促進與細胞增殖、分化、凋亡、血管生成等有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄［6，7］，最終促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

當細胞因子或生長因子與細胞膜上的受體結(jié)合后，JAKs與受體胞漿區(qū)域的JAKs結(jié)合位點結(jié)合后發(fā)生酪氨酸磷酸化而活化，JAKs磷酸化受體上的酪氨酸位點，使受體能夠聚集胞漿內(nèi)的STAT3，STAT3通過SH2區(qū)域?qū)TAT補位到受體上的酪氨酸位點，JAKs能使STAT3 705位酪氨酸發(fā)生磷酸化，兩個磷酸化的STAT3形成二聚體移至細胞核，可與特定的DNA序列結(jié)合，進而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄［8，9］。Haan等［10］依據(jù)STAT3 SH2結(jié)構(gòu)域的一段氨基酸序列合成肽段Biotion-bA-PGSAAPpYLKTKFI，采用ELISA方法驗證肽段和STAT3 SH2區(qū)域形成二聚體，進而說明兩個磷酸化的STAT3可以通過SH2區(qū)域形成二聚體。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，自動化技術(shù)和計算機技術(shù)的進步，檢測技術(shù)的日趨靈敏，產(chǎn)生了多種分子細胞水平的藥物篩選模型，降低試驗試劑和化合物的用量，減少試驗成本，推進藥物篩選的進程。STAT3近年來成為研究的熱點，本研究根據(jù)STAT3形成二聚體的性質(zhì)，建立以STAT3為靶標的抗腫瘤高通量篩選模型，并應(yīng)用該模型尋求能夠阻斷STAT3形成二聚體的特異性強、高效、毒副作用小、成本低的抑制劑，用來作為抗癌藥物的先導(dǎo)化合物，并在細胞水平上利用MTT法測定所篩選出化合物對肝癌細胞增殖的影響，最后對化合物進行進一步的優(yōu)化和驗證，旨在研發(fā)新的抗癌類藥物，為癌癥的治療帶來新的希望。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌菌株DH5α，BL21（DE3），原核表達載體pET-28a均為本實驗室保存。PfuDNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自Fermentas公司；Biospin質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒及瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自Bio Flux；F96 MAXISORP—Nunc Immuno Plate（型號442404）、抗His標簽鼠單克隆抗體及HRP標記山羊抗小鼠Ig G抗體購自Thermo Fisher；牛血清蛋白（BSA）和鏈霉親和素購自上海生工生物工程有限公司；二甲基亞砜（DMSO）等化學(xué)試劑為市售分析純。肽段底物（Biotion-bAPGSAAPpYLKTKFI）由吉爾生化有限公司合成。?KTA FPLC蛋白純化系統(tǒng)購自GE Healthcare；Multiskan FC 酶標儀購自Thermo fisher scientific。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建 由GenBank獲取小鼠STAT3（127AA-722AA）［11，12］序列（BC003806.1），設(shè)計上游引物：5'-AAGGATCCGGCCAGGCCAACCAC-3'（酶切位點BamHⅠ），下游引物：5'-CCCTCGAGCTAGTCAATGGTATTGC-3'（酶切位點XhoⅠ）。將STAT3的PCR產(chǎn)物及載體pET-28a都分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，將PCR產(chǎn)物和載體的酶切產(chǎn)物進行回收，再用T4 DNA連接酶進行酶連，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，重組質(zhì)粒的提取、酶切、PCR以及瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定插入片段的正確性。

1.2.2 蛋白表達、純化和鑒定 將含有目的基因的重組單克隆接種于含100 μg/mL卡那霉素的5 mL LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)過夜。次日將培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)接于800 mL含100 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600≈0.6，將培養(yǎng)液溫度降到16℃后加入終濃度為0.4 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)蛋白表達，培養(yǎng)18 h。4℃ 5 000 r/min離心30 min，棄上清，加25 mL懸菌緩沖液（25 mmol/L Tris，pH8.0，300 mmol/L NaCl，10%甘油）將菌體懸浮，高壓細胞破碎儀破菌后，4℃ 15 000 r/min離心，取上清過Ni2+-NTA瓊脂糖柱，梯度咪唑沖洗蛋白，濃縮蛋白至1 mL后換溶液（20 mmol/L Tris，pH8.0，200 mmol/L NaCl，5%甘油，2 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA）過Superdex 200。將純化得到的蛋白進行蛋白免疫印記雜交試驗。

1.2.3 抑制劑篩選方法 酶聯(lián)免疫吸附法：（1）用100 μL的鏈霉親和素包被NUNC 96孔板，16℃過夜。（2）次日棄去板上剩余的鏈霉親和素溶液，用

PBST溶液（1×PBS，pH7.4，0.05% Tween 20）洗3次后，加入200 μL PBST溶解的BSA封閉37℃ 2 h。（3）棄去孔中剩余的封閉液，加入100 μL肽段底物溶液37℃孵育1 h。（4）棄去孔中未結(jié)合的底物溶液，用PBST溶液清洗96孔板3次后加入100 μL蛋白溶液，37℃孵育1 h。（5）棄去未結(jié)合的蛋白溶液，PBST溶液清洗96孔板3次后加入100 μL用PBST+1%BSA溶液稀釋的一定濃度的抗His標簽鼠單克隆抗體，37℃孵育1 h。（6）棄去未結(jié)合的抗His標簽鼠單克隆抗體溶液，用PBST溶液清洗96孔板4-5次，然后加入100 μL用PBST+1%BSA溶液稀釋的一定濃度的HRP標記山羊抗小鼠Ig G抗體，37℃孵育1 h。（7）棄去未結(jié)合的HRP標記山羊抗小鼠Ig G抗體溶液，加入100 μL底物緩沖液（0.2 mol/L 醋酸鈉，pH5.0）、500 μL TMB溶液和32 μL 0.75% H2O2的混合溶液37℃孵育15-30 min，然后加入100 μL濃度為2 mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，最后用Multiskan FC 酶標儀檢測450 nm處的吸光值。1.2.4 高通量藥物篩選模型的優(yōu)化、評價和應(yīng)用 使用酶聯(lián)免疫吸附法摸索優(yōu)化篩選條件，確定使用BSA、肽段底物、蛋白濃度以及抗His標簽鼠單克隆抗體、HRP標記山羊抗小鼠Ig G抗體的用量，建立穩(wěn)定的篩選體系。對8 248種藥物進行篩選。針對抑制率80%以上的藥物進行復(fù)篩，并測定藥物對蛋白底物相互作用抑制的IC50值。

計算下列模型評價指標：

Z'：統(tǒng)計學(xué)指標，Z'≥0.5信噪比大數(shù)據(jù)重復(fù)性較好，比較優(yōu)秀的藥物篩選體系。AVGmax：最大平均值；AVGmin：最小平均值；SDmax：最大標準差；SDmin：最小標準差；n：孔數(shù)。

1.2.5 藥物篩選 初篩樣品8 248個，采用1 μL純度為95%的DMSO作為陰性對照組，不加目的蛋白換為加入相同體積的緩沖液為陽性對照組，使用96孔板進行藥物篩選計算藥物對多肽底物和目的蛋白相互作用的抑制率公式：

抑制率=（陰性對照組-試驗組）/（陰性對照組-陽性對照組）×100%

對抑制率大于80%的樣品進行復(fù)篩。復(fù)篩時將樣品從2 mmol/L進行梯度稀釋，稀釋10-20個梯度，分別檢測和計算每個濃度的抑制率，以濃度的對數(shù)值為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖，擬合求得IC50。1.2.6 MTT比色法［13］測定所篩選化合物對肝癌細胞作用 （1）將處于對數(shù)生長期的肝癌細胞進行稀釋并分裝到96孔板中，每孔100 μL，96孔板最后一列只加滅過菌的PBS溶液作為對照測量孔。（2）將96孔板放在細胞培養(yǎng)箱（溫度37℃，5% CO2），加入待測藥物，放置在細胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）中培養(yǎng)16-48 h，在倒置顯微鏡下進行觀察。（3）呈色：向各孔中加入20 μL的MTT溶液（濃度為0.5%），放回細胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）繼續(xù)培養(yǎng)，使MTT進入細胞并發(fā)生反應(yīng)，約4 h后終止培養(yǎng)，小心將孔內(nèi)的培養(yǎng)液吸出棄掉。（4）向每孔中加入150 μL純度為95%的DMSO，振動板5-10 min。（5）使用酶標儀測量490 nm處每個孔溶液的吸光值。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的克隆以及目的蛋白的表達純化

構(gòu)建的表達載體經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切電泳結(jié)果與預(yù)期相符，插入DNA片段與目的基因?qū)嶋H大小（1 788 bp）一致，測序結(jié)果表明，STAT3（127-722AA）基因序列和插入載體的方向均正確。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）菌株，IPTG誘導(dǎo)目的蛋白大量表達。SDS-PAGE分析和免疫印記分析如圖1所示。

2.2 藥物篩選模型的建立和優(yōu)化

2.2.1 BSA濃度梯度對篩藥體系的影響 設(shè)置不同的鏈霉親和素的濃度梯度及BSA溶液濃度梯度，初步設(shè)定底物肽段濃度為5 μg/mL，蛋白濃度為5 μg/mL，抗His標簽鼠單克隆抗體濃度為0.5 μg/mL，HRP標記山羊抗小鼠Ig G抗體濃度為0.5 μg/mL，測量450 nm處吸光值，結(jié)果（圖2）顯示，包被上5 μg/mL的鏈霉親和素后，隨著封閉液濃度的增大，數(shù)值不斷地減小，BSA濃度為1%時效果最好，所

以選取1% BSA作為封閉液。

圖1 SDS-PAGE分析（A）和免疫印記分析（B）

圖2 鏈霉親和素和BSA濃度梯度的影響

圖3 蛋白濃度和抗His標簽鼠單克隆抗體濃度梯度的影響

圖4 不同的鏈霉親和素濃度和肽段底物濃度的影響

2.2.2 蛋白和抗His標簽鼠單克隆抗體濃度梯度對篩藥體系的影響 選取蛋白濃度梯度、不同抗His標簽鼠單克隆抗體濃度，確定鏈霉親和素濃度為5 μg/mL，肽段底物濃度為5 μg/mL，HRP標記山羊抗小鼠Ig G抗體濃度為0.5 μg/mL，測量450 nm處的吸光值，結(jié)果如圖3所示。結(jié)合篩選的可行性，確定抗His標簽鼠單克隆抗體濃度為0.25 μg/mL，蛋白濃度為75 μg/mL。

2.2.3 鏈霉親和素和肽段底物的濃度梯度對篩藥體系的影響 確定體系中BSA濃度為1%，蛋白濃度為75 μg/mL，抗His標簽鼠單克隆抗體濃度為0.25 μg/mL，再設(shè)置不同鏈霉親和素的濃度梯度，不同肽段底物的濃度梯度，測量450 nm處的吸光值（圖4）。確定最佳的鏈霉親和素濃度為5 μg/mL，肽段底物濃度為5 μg/mL。

綜上可知，最終確定的高通量藥物篩選體系中：鏈霉親和素包被濃度為5 μg/mL，底物肽段濃度為5 μg/mL，封閉液BSA濃度為1%，蛋白濃度為75 μg/mL，抗His標簽鼠單克隆抗體濃度為0.25 μg/mL，HRP標記山羊抗小鼠Ig G抗體濃度為0.5 μg/mL。

2.3 藥物篩選模型的穩(wěn)定性評價

2.3.1 篩選體系中各組分的影響 在體系中依次不加入鏈霉親和素、抗His標簽鼠單克隆抗體、底物肽段、蛋白，檢測其對吸光值的影響，結(jié)果如圖5所示。計算信噪比S/N=8.23＞3，是比較理想的信噪比。

2.3.2 篩選模型評價指標計算 根據(jù)篩藥體系中陰性對照組和陽性對照組的數(shù)據(jù)計算變異系數(shù)（CV）和Z'，進而對該模型進行可行性分析，將優(yōu)化后的體系于96孔板中進行反應(yīng)，設(shè)置陰性對照96孔板（正常反應(yīng)體系）和陽性對照96孔板，連續(xù)3 d，每天進行一次體系驗證。CV陰性對照=2.04%＜20%；CV陽性對照=4.94%＜20%；Z'=0.91＞0.5。各項指標均符合模型篩選的要求。

2.4 藥物篩選結(jié)果

對8 248個藥物進行篩選，抑制率在80%以

上的有5種，在500 μmol/L藥物濃度下，化合物MDC6的抑制率最高，為92%，進行IC50值的測定，IC50值最低達到3.37 μmol/L。化合物MDC6 名稱為（1E，6E）-1，7-bis（3，4，5-trimethoxyphenyl）hepta-1，6-diene-3，5-dione，分子式為C25H28O8，結(jié)構(gòu)式如圖6所示，IC50值如圖7所示。

圖5 篩選體系中各組分的影響

圖6 化合物MDC6的結(jié)構(gòu)（C25H28O8）

圖7 化合物MDC6 IC50值的測定

2.5 細胞水平上對化合物 MDC6的測定

利用MTT法在肝癌細胞上進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物MDC6對肝癌細胞的生長和增殖有較好的抑制作用，IC50值15.92 μmol/L。用Graph Pad Prism 5.0軟件計算MDC6在對肝癌細胞的IC50值如圖8所示。在MDCK細胞（狗腎細胞）中進行CC50測定，終濃度為200 μmol/L 時，其對細胞的致死率仍然小于30%，即CC50＞200 μmol/L，也就是15.92 μmol/L的MDC6對普通細胞無影響。

圖8 細胞水平MDC6的IC50值

3 討論

STAT3參與調(diào)節(jié)機體的許多生理功能，能夠抑制細胞凋亡，促進細胞增殖，在人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和演進中起到重要作用，其過量表達與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切。STAT3是近幾年新興的非常有潛力的抗癌靶點，位于JAK-STATs信號通路的最末端，具有較大的優(yōu)勢，篩選出抑制其活性的化合物就可以抑制整個信號通路，所以建立以STAT3為靶標的高通量篩選模型，并應(yīng)用該模型篩選STAT3抑制劑對于腫瘤的治療具有重要意義。

藥物篩選是發(fā)現(xiàn)新藥的初始階段，目前存在很多種藥物篩選方法，包括電泳遷移位移試驗（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）［14］、酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA）［15］和熒光偏振試驗（Fluorescence polarization，F(xiàn)P）［16］。我們使用高通量藥物篩選技術(shù)，是基于分子水平和細胞水平的試驗方法進行檢測，能夠大規(guī)模地微量快速篩選藥物的新方法。在高通量藥物篩選過程中，方法的選擇和構(gòu)建是最重要的一個環(huán)節(jié)。高通量藥物篩選具有速度快、成本低的優(yōu)點，本研究建立的ELISA高通量STAT3抑制劑藥物篩選模型，具有以下特點：反應(yīng)體積小，特異性強；操作系統(tǒng)自動化；檢測靈敏快速；結(jié)果穩(wěn)定，在每塊試驗板上均同時設(shè)立空白和對照，從而使得結(jié)果具有可比性；測定結(jié)果可信度高，具有較高的篩選效率，大大提高研發(fā)新藥的效率。在試驗中發(fā)現(xiàn)部分樣品具有STAT3的激動作用，這在設(shè)計試驗時沒有考慮，若將該方法略微改進也可作為STAT3激動劑的篩選模型進行使用。

近年來有關(guān)STAT3研究較多，但在大規(guī)模藥物篩選中的使用還較少，所以建立穩(wěn)定可靠的高通量藥物篩選模型具有重要意義。本研究建立的方法雖也存在一定的局限性，如操作步驟較多、需要多次洗板等，但由于本試驗使用的試劑和化合物用量少，尤其是在大規(guī)模藥物篩選過程中，能夠有效的降低篩選成本，從而使得該方法具有較高的實用價值。

運用該模型進行藥物篩選，得到化合物MDC6，在分子水平和細胞水平進行IC50值的測定。可在此基礎(chǔ)上對化合物進行進一步的優(yōu)化和驗證，以研發(fā)新的抗癌類藥物，為癌癥的治療帶來新希望。

4 結(jié)論

基于酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），摸索STAT3蛋白和抗體用量、肽段底物和鏈霉親和素的條件等，確定了體系中各組分的相應(yīng)濃度，同時對模型穩(wěn)定性、可靠性進行綜合評價分析，在分子水平上成功建立了STAT3抑制劑的高通量篩選模型。應(yīng)用該模型對8 248個樣品進行篩選，發(fā)現(xiàn)一種化合物MDC6在500 μmol/L藥物濃度下，抑制率為92%，對其進行IC50值的測定時，在分子水平上達到3.37 μmol/L，在細胞水平上達到15.92 μmol/L，對STAT3蛋白有明顯抑制作用。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Establishment and Application of a High Throughput Screening Model for Inhibitors of STAT3

Pan Li Zhang Ning Niu Guojun Meng Jing Liu Xiang Yang Cheng
（1. College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457；2. College of Pharmacy，Nankai University，Tianjin 300071；3. Tianjin International Joint Academy of Biotechnology and Medicine，Tianjin 300457；4. College of Life Sciences，Nankai University，Tianjin 300071）

It was to establish a viable high-throughput drug screening model for discovering inhibitors of Signal Transducer and Activator of Transcription3, and applied the model to screen potential anti-cancer drugs. The STAT3 gene was amplified with PCR and cloned into the expression vector pET-28a. The recombinant STAT3 was over-expressed and purified, and then was used to bind with specific phosphotyrosine peptides. We established a high-throughput drug screening model based on ELISA to obtain some effective compounds. Further, we tested the effect of them on the growth ability and proliferation of the Hepatoma cells using MTT assay. Results showed that it was not only successfully constructed the expression vector pET-28a-STAT3, but also established a reliable and stable model for drug screening. Besides, 8 248 samples were screened, and a positive sample MDC6 was finally obtained. When the drug concentration was less than 500 μmol/L, the inhibition rate of MDC6 reached 92%. The minimum value of IC50was 3.37 μmol/L, while at the cellular level it was 15.92 μmol/L. In this work, we developed a repeatable and reliable assay for screening of STAT3 inhibitors.

STAT3 Target High-throughput drug screening model ELISA

2014-01-13

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31200641）

潘麗，女，碩士研究生，研究方向：高通量藥物篩選；E-mail：panlippg@126.com

楊誠，男，博士，教授，研究方向：微生物與生化藥學(xué)；E-mail：cheng.yang@htmdc.org