雷帕霉素對RAW264.7 巨噬細胞10 種與細胞自噬相關的miRNAs表達的影響①

張 濤 鄭錫銘 周林林 劉 鑫 趙 瑾 徐廣賢

(寧夏醫科大學檢驗學院，銀川 750004)

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長約21～25 個核苷酸長度的非編碼單鏈小分子RNA，其廣泛存在于真核生物中［1］。它主要通過作用于靶基因的3’端非翻譯區(3’-untranslated region，3’-UTR)抑制靶基因mRNA 的翻譯或使其降解［2］。當機體受到外來刺激時，miRNA 可以通過調控信號通路中的關鍵基因，從而在多個環節調節免疫反應。其中自噬(Autophagy，ATG)途徑在這一反應中起著重要作用，自噬是一種高度保守的生物學代謝機制，主要發揮著細胞內降解和蛋白的循環利用等功能［3，4］。細胞自噬對維持內環境平衡是不可或缺的，因此自噬活性的改變、自噬通路的異常調節通常與一些疾病相關。

miRNA 參與細胞自噬途徑的調控，通過靶向作用于自噬途徑中的相關基因進而影響自噬的水平。已有文獻報道miR-101［3］，miR-30a［5］，miR-376b［6］，miR-181a［7］等直接靶標STMN1、ATG4D、RAB5A、Beclin1、ATG4C、ATG5、和BNCN1 等自噬基因抑制自噬 的 發 生;miR-30d (靶 標 BECN1、BNIP3L、ATG12、ATG5 和ATG2 等)抑制自噬的發生，對自噬機制研究有重要意義［8］;另外研究表明miR-21［10］，miR-212/132［9］、miR-502［11］、miR-130a［12］、miR-199a-5p［13］對自噬發生也具有重要作用。這些miRNA 的表達異常與自噬水平密切相關，使得miRNA成為因自噬的異常引起的腫瘤、感染、神經退行性病變等疾病的潛在治療靶點。

最近研究表明自噬異常可能與腫瘤、感染、神經退行性病變等疾病有關［14，15］，而自噬的調控又與miRNA 的表達水平密切相關。本研究通過TargetScan、miRanda 等生物信息學軟件預測與自噬相關的特異性miRNA 分子。利用Real-Time PCR 檢測方法檢測雷帕霉素對RAW264.7 巨噬細胞中miR-200a、miR-30b 等10 個miRNA 表達的影響，而目前關于這些miRNAs 在雷帕霉素誘導巨噬細胞后的表達水平以及對細胞自噬調控機制尚未見報道，因此本研究為進一步驗證這些miRNAs 在細胞自噬途徑中的調控作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料與試劑 胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)和DMEM 培養基購自Gibco 公司;雷帕霉素(Rapamyclin)購自Sigma 公司;反轉錄試劑盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)購自Thermo 公司;Small RNA 提取試劑盒(RNAiso for SmallRNA)購自美國Invitrogen 公司;SYBR GreenⅠ試劑盒購自TaKaRa;TaKaRa TaqVersion 2.0 購自TaKaRa 公司;RAW264.7 細胞為小鼠來源的巨噬細胞系(本實驗室保存);DH5α 感受態細胞為本實驗室保存。

1.1.2 引物的設計與合成 根據文獻設計莖環法檢測引物，分別為莖環逆轉錄引物、RT-PCR 上游與下游引物。Real-Time PCR 通用下游引物:CTCAACTGGTGTCGTGGA;內參基因U6 上游引物:CTCGCTTCGGCAGCACA;U6 下游引物:AACGCTTCACGAATTTGCGT。根據miRBase 數據庫中成熟的miRNA 序列分別設計莖環引物(表1)和特異性檢測引物(表2)。

1.2 方法

1.2.1 MicroRNA 的生物信息學預測 利用microRNA.org、Target Scan、miRanda 及PicTar 等生物信息學軟件查閱文獻確定將miR-30b、miR-30c、miR-106a、miR-214、miR-183、miR-200a、miR-376c、miR-17-5p、miR-142-3p、miR-377 作為研究對象。

1.2.2 細胞培養及細胞模型的建立 第一天將小鼠RAW264.7 巨噬細胞復蘇，向RAW264.7 細胞加入5 ml 含10%胎牛血清(FBS)的DMEM 培養液，二者均置于37℃﹑5%CO2培養箱中培養。將細胞分到六孔板中，等到細胞長到80%左右時，正常組換成含10%胎牛血清(FBS)的DMEM 培養基，實驗組采用50 μg/ml 雷帕霉素的含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養基培養細胞。

1.2.3 Real-Time PCR 檢測

表1 莖環反轉錄引物Tab.1 Primers used for reverse transcription

表2 Real time PCR 上游檢測引物Tab.2 Forward primers used for qRT-PCR

1.2.3.1 利用莖環引物反轉錄為cDNA 與T 載體的構建 采用Small RNA 提取試劑盒從細胞中提取RNA，根據thermo 反轉錄試劑盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)說明書，以RNA 為模板反轉錄為cDNA;利用特異的microRNA 上游引物、通用下游引物各1 μl，模板cDNA 2 μl 進行PCR 反應，用3%的瓊脂糖凝膠電泳，產物回收之后，參照Invitrogen T 載體說明書將目的片段與T 載體連接，測序鑒定。

1.2.3.2 構建標準曲線 將miRNA 重組T 載體稀釋到1 ng/μl，進行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍比稀釋，各取2 μl 做模板，構建標準曲線。

1.2.3.3 檢測miRNAs 的表達水平 利用Small RNA 提取試劑盒從RAW264.7 細胞中提取RNA，反轉錄后用于Real-Time PCR 檢測，利用羅氏light cycler 實時定量PCR 儀，反應體系為SYBR Premix Ex.TaqTM(2×)10 μl，PCR 上游引物(10 μmol/L)0.8 μl，PCR 下游引物(10 μmol/L)0.8 μl，模板2 μl，RNA-free water 補充至20 μl。反應程序為:95℃30 s 1 cycle ;95℃5 s，Tm 30 s，72℃30 s，40 cycle;37℃20 min 1 cycle;實驗設置2 個平行復孔，取平均值。

1.3 統計學處理 所有數據采用SPSS20.0 統計軟件進行統計學分析，所有數據采用單因素方差分析，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RAW264.7 細胞中microRNA 的擴增 細胞中提取的Small RNA 經莖環引物反轉錄cDNA 后，PCR 產物經3%瓊脂糖凝膠電泳條帶如圖1 所示。測序結果表明構建T 載體正確;檢測結果表明提取的small RNA 質量較好，反轉錄產物cDNA 質量較好，可以用于后續Real-Time PCR 實驗。

2.2 熒光定量PCR 結果

2.2.1 雷帕霉素處理細胞2 h 后，經過Real-Time PCR 檢測發現miR-30b、miR-30c、miR-106a、miR-214、miR-183、miR-200a、miR-376c、miR-17-5p、miR-142-3p是表達上調(＞2.5 倍P ＜0.05);而miR-377 則是顯著性表達下調(＞50 倍，P ＜0.05)，如圖2 所示。

2.2.2 雷帕霉素處理細胞4 h 后，經過Real-Time PCR 檢測發現miR-17-5p、miR-106a、miR-377 顯著性表達上調(＞2 倍，P ＜0.05)，miR-183、miR-200a表達下調(＞2.1 倍，P ＜0.05)，如圖3 所示。

2.2.3 雷帕霉素處理細胞6 h 后，經過Real-Time PCR 檢測發現miR-30b、miR-30c、miR-106a、miR-183、miR-200a、miR-376c、miR-17-5p、miR-142-3p 是表達上調(＞2.8 倍，P ＜0.05)，如圖4 所示。

2.2.4 雷帕霉素處理細胞8 h 后，經過Real-Time PCR 檢測發現miR-30c、miR-106a、miR-214、miR-183、miR-200a、miR-376c、miR-142-3p 是表達上調(＞2.4 倍，P ＜0.05);而miR-30b、miR-377 則是顯著性低表達(＞50 倍，P ＜0.05)，如圖5 所示。

圖1 microRNA PCR 擴增產物Fig.1 Results of PCR

圖2 雷帕霉素處理細胞2 h 后檢測miRNAs 的表達Fig.2 Results of expression of miRNAs after cells were treated by rapamycin for 2 hours

圖4 雷帕霉素處理細胞6 h 后檢測miRNAs 的表達Fig.4 Results of expression of miRNAs after cells was treated by rapamycin for 6 hours

圖5 雷帕霉素處理細胞8 h 后檢測miRNAs 的表達Fig.5 Results of expression of miRNAs after cells were treated by rapamycin for 8 hours

3 討論

自噬(Autophagy)是廣泛存在于真核細胞中的生命現象，是生物在發育、衰老的過程中存在的一個消除自身多余或者受損細胞器以及維持細胞穩態的共同機制［16］。自噬被誘導后，細胞內形成一種稱為隔離膜或吞噬泡的小囊泡樣結構，并與需降解的胞漿成分集結在一起，然后隔離膜延伸并包裹封閉胞漿成分形成一個雙層膜的結構，即自噬體，自噬體與溶酶體直接融合形成自噬溶酶體，包裹的胞漿成分最終在溶酶體酶的作用下被降解利用［17，18］。在此過程中，一些自噬相關基因的表達，如atg5、atg7、atg8、atg12 等對自噬的形成至關重要［19］。雷帕霉素作為細胞自噬發生常用的誘導劑之一，通過抑制mTOR 途徑，從而誘導自噬的發生。

已經有文獻報道miR-17-5p 參與調控細胞自噬的過程，并且通過靶向ATG7 從而抑制細胞自噬，抑制LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉變［20］。另有研究表明，miR-17 在炎癥通路中也具有重要調節作用，miR-17 和miR-106a 通過靶向作用于信號調節蛋白α(signalregulatory protein α，SIRPα)調節巨噬細胞免疫反應［21］。miR-183 敲除后抑制MTC 的增殖，并且影響自噬的水平［22］。本研究結果表明雷帕霉素作用RAW264.7 巨噬細胞后，分別于2、4、6 h miR-17-5p、miR-106 表達上調(大于2.1 倍P ＜0.05)，miR-214在2、8 h 表達上調(大于2.4 倍，P ＜0.05)。另外實驗結果表明miR-30b、miR-30c、miR-183、miR-200a、miR-376c、miR-142-3p 在2、6、8 h 表達上調(大于2.4 倍，P ＜0.05)，而miR-183、miR-200a 在4 h 表達下調(大于2.1 倍，P ＜0.05)，miR-30b 在8 h 則顯著性表達下調(大于50 倍，P ＜0.05)。miR-377 在4 h 則是表達上調(大于2.5 倍，P ＜0.05)，但在2、8 h 則是顯著表達下調(大于50 倍，P ＜0.05)，說這些miRNA 可能在不同時間段內對細胞自噬起著正/負向調控作用。

本實驗建立雷帕霉素誘導細胞模型，定量檢測結果表明雷帕霉素誘導細胞后miR-30b、miR-30c、miR-106a、miR-214、miR-183、miR-200a、miR-376c、miR-17-5p、miR-377 發生顯著性變化。其中miR-17-5p、miR-183 已被證明參與調控細胞自噬的過程［16，17］，而miR-30b、miR-30c、miR-376c、miR-200a、miR-377、miR-142、miR-106a、miR-214 調控細胞自噬的機制目前尚不明確根據實驗結果。我們根據實驗結果推測這些miRNA 分子可能通過靶向某些自噬相關基因從而促進或者抑制自噬的水平。我們將對其進行深入的研究與探討，本實驗為探究miRNA 在調控細胞自噬過程中發揮的作用而提供理論依據。

［1］Chen K，Song F，Calin GA，et al.Polymorphisms in microRNA targets:a goal mine for molecular epidemiology［J］.Carcinog-enesis，2008，29(7):1306-1311.

［2］Pfeffer S，Zavolan M，Grsser FA，et al.Identification of virus encoded microRNAs［J］.Science，2004，304(5671):734-736.

［3］Rabinowitz JD，White E.Autophagy and metabolism［J］.Science，2010，330(6009):1344-1348.

［4］Levine B，Kroemer G.Autophagy in the pathogenesis of disease［J］.Cell，2008，132(1):27-42.

［5］Frankel LB，Wen J，Lees M，et al.MicroRNA-101 is a potent inhibitor of autophagy［J］.EMBO J，2011，30(22):4628-4641.

［6］Pan WY，Zhong Y，Cheng C，et al.MiR-30-regulated autophagy mediates angiotensin II-induced myocardial hypertrophy ［J］.PLoS One，2013，8(1):e53950.

［7］Korkmaz G，le Sage C，Tekirdag KA，et al.MiR-376b controls starvation and mTOR inhibition-related autophagy by targeting ATG4C and BECN1［J］.Autophagy，2012，8(2):165-176.

［8］Tekirdag KA，Korkmaz G，Ozturk DG，et al.MIR181A regulates starvation-and rapamycin-induced autophagy through targeting of ATG5［J］.Autophagy，2013，9(3):374-385.

［9］Yang X，Zhong X，Tang JL，et al.MiR-30d Regulates multiple genes in the autophagy pathway and impairs autophagy process in human cancer cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2013，431(3):617-622.

［10］Ucar A，Gupta SK，Fiedler J，et al.The miRNA-212/132 family regulates both cardiac hypertrophy and cardiomyocyte autophagy［J］.Nat Commun，2012，3:1078.

［11］Gawky HS，Kim TH，Jo GH，et al.Silencing of microRNA-21 confers radio-sensitivity through inhibition of the PI3K/AKT pathway and enhancing autophagy in malignant glioma cell lines［J］.PLoS One，2012，7(10):e47449.

［12］Zhai H，Song B，Xu X，et al.Inhibition of autophagy and tumor growth in colon cancer by miR-502.［J］.Oncogene，2013，32(12):1570-1579.

［13］Kovaleva V，Mora R，Park YJ，et al.miRNA-130a targets ATG2B and DICER1 to inhibit autophagy and trigger killing of chronic lymphocytic leukemia cells［J］.Cancer Res，2012，72(7):1763-1772.

［14］Yi H，Liang B，Jia J，et al.Differential roles of miR-199a-5p in radiation-induced autophagy in breast cancer cells［J］.FEBS Lett，2013，587(5):436-443.

［15］Majolica D，Prescott M，Devenish RJ.Autophagy in disease［J］.Methods Mol Boils，2010，648:79-92.

［16］Nakatogawa H，Suzuki K，Kamada Y，et al.Dynamics and diversity in autophagy mechanisms:lessons from yeast［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2009，10(7):458-467.

［17］Kuma A，Mizushima N.Physiological role of autophagy as an intracellular recycling system:with an emphasis on nutrient metabolism［J］.Semin Cell Dev Biol，2010，21(7):683-690.

［18］Rabinowitz JD，White E.Autophagy and metabolism ［J］.Science，2010，330(6009):1344-1348.

［19］Marino G，LopezOtin C.Autophagy:molecular mechanisms，physio logical functions and relevance in human pathology［J］.Cell Molife Sci，2004，61(12):1439-1454.

［20］Comincini S，Allavena G，Palumbos，et al.MicroRNA-17 regulates the expression of ATG7 and modulates the autophagy process，improving the sensitivity to temozolomide and low-dose ionizing radiation treatments in human glioblastoma cells.［J］.Cancer Biol Ther，2013，14(7):574-586.

［21］Zhu D，Pan C，Li L，et al.MicroRNA-17/20a/106a modulate macrophage inflammatory responses through targeting signal-regulatory protein alpha［J］.J Allergy Clin Immunol，2013，132(2):426-436.

［22］Gundara JS，Robinson BG，Sidhu SB，et al.Evolution of the“autophagamiR”［J］.Autophagy，2011，7(12):1553-1554.