FLT3基因突變對急性髓系白血病的影響

朱柏貴， 張蘇江， 李建勇，高鴻敏

FLT3基因突變對急性髓系白血病的影響

朱柏貴1， 張蘇江2， 李建勇2，高鴻敏3

目的探討FMS樣酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosie kinase3,FLT3)基因突變對急性髓細胞樣白血病(acute myeloid leukemia,AML)的影響。方法采用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)結合直接測序和克隆測序對50例初診AML患者FLT3突變進行研究，并結合臨床資料進一步分析。結果正常核型AML患者FLT3基因內部串聯重復(internal tandem duplication,ITD)陽性檢出率20%，高于異常核型(6.25%)；與野生組相比，FLT3-ITD(+)突變患者初診時白細胞計數、血紅蛋白及骨髓原始細胞比例均高，緩解率低。結論FLT3突變是正常核型AML患者的主要分子標志，其對疾病預后及靶向治療具有重要意義。

FMS樣酪氨酸激酶3；急性髓系白血病；基因突變

急性白血病患者的染色體核型分析為疾病治療反應和生存預后提供了非常重要的生物學信息。近年來，學者指出多種分子標記物與疾病具有顯著的預后相關性，并有利于急性白血病更加精細的分類和預后評估。FMS樣酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosie kinase3,FLT3)基因內部串聯重復(internal tandem duplication, ITD)是AML患者中發現的常見突變類型，其在AML中的發生率可達15%～35%。研究顯示，FLT3突變與外周血高白細胞，骨髓高白血病細胞比例有關，是影響AML預后的重要因素[1，2]，FLT3第二酪氨酸激酶結構域(tyrosine kinase domain, TKD)點突變主要是835和836位氨基酸的點突變，其發生率較于FLT3-ITD為低，其預后意義尚存在爭議。本研究旨在進一步探討FLT3突變在AML患者中的發生情況，分析其臨床特征、療效及與預后的關系。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2010-04至2013-01于南京醫科大學第一附屬醫院診治的50例初診AML患者。其中男27例,女23例；中位年齡43歲(8～76歲)。所有患者均經過骨髓細胞形態學、免疫表型、染色體和融合基因檢查確診，參照FAB標準及WHO標準：M01例,M14例,M220例,M38例,M46例,M57例,M64例。5名正常對照為南京醫科大學第一附屬醫院體檢正常者。

1.2 方法

1.2.1 染色體核型分析 50例病例標本應用R顯帶技術進行核型分析，治療前抽取患者的骨髓5 ml，肝素抗凝，采用直接法及不加植物血凝素的短期培養法制備染色體標本，然后采取改良的熱處理吉姆薩R顯帶技術分析20個以上分裂象細胞核型，核型按“人類染色體國際命名體制(ISCN2005)”進行描述。

1.2.2 基因組DNA提取 所有患者均在獲得知情同意后抽取骨髓液5 ml用于常規免疫表型和細胞遺傳學分析，剩余骨髓液用淋巴細胞分離液分離出單個核細胞，采用傳統酚-氯仿抽提法提取DNA，應用紫外分光光度儀測定樣本的OD值，去離子水稀釋DNA至50 ng/μl，-20 ℃保存備用。

1.2.3 FLT3基因突變檢測

1.2.3.1 FLT3-ITD突變檢測 PCR擴增參照文獻[3,4]方法,針對FLT3基因外顯子14、15設計引物(上海英俊公司合成)，正義鏈：5′-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3′；反義鏈：5′-CTTTCAGCATTT-TGACGGCAACC-3′。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72℃ 8 min，4 ℃保存。野生型擴增產物為329 bp處出現單一峰，ITD突變型擴增產物為在大于329 bp處出現特異性條帶。FLT3-ITD電泳陽性標本克隆測序，測序結果與野生型基因序列比對。

1.2.3.2 FLT3-TKD點突變檢測 PCR擴增，針對FLT3基因外顯子20設計引物，擴增片段(479bp)包含D835和I836點突變所在區域。引物正義鏈：5′-GCTCGGAATCTGCAAAAGAT-3′，反義鏈：5′-CACCACAGTGAGTGCAGTTG-3′。反應條件同FLT3-ITD，酶切反應按照EcoRV(紐英倫生物技術有限公司)說明書進行操作，PCR擴增產物6 μl 中加入EcoRV內切酶6 U，10×EcoRV內切酶緩沖液2 μl，加滅菌雙蒸水至終體積20 μl，37 ℃恒溫反應3 h進行酶切反應，酶切結束后2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果，于凝膠成像儀的紫外光下觀察目的條帶。FLT3基因的編碼D835和I836的GATATC序列可被EcoRV識別酶切，若D835和I836的任一位置發生點突變的標本發生改變，則EcoRV不能酶切該序列。對FLT3-TKD(+)標本進行PCR擴增，送上海英俊公司進行測序驗證。

1.2.4 克隆測序 選取瓊脂糖電泳FLT3-ITD突變型標本，對PCR擴增產物進行回收并純化，用pUCm-T載體(上海英俊公司產品)進行克隆測序(上海英俊公司完成)，結果與正常序列比對分析突變發生的位置和類型。

1.3 統計學處理 采用SPSSA16.0統計學軟件進行分析，采用χ2檢驗進行差異性檢驗，計量資料采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 FLT3-ITD突變分析 正常健康對照者瓊脂糖電泳分析顯示在329 bp處出現單一條帶，50例初診AML患者中5例FLT3-ITD突變陽性，男2例，女3例。中位年齡43(7～67)歲。對其中3例陽性樣本進行克隆測序顯示：ITD片段長度不等，重復區域各不相同，均為框內突變。

2.2 FLT3-TKD點突變分析 50例中FLT3-TKD(+)2例(4%)，其中1例為D835 Y，天冬氨酸變為酪氨酸，另1例為I836 M，均為雜合突變。

2.3 染色體核型分析 50例AML患者染色體核型分析結果顯示，14例無分裂相，在20例正常核型中FLT3-ITD(+)4例(20%)，FLT3-TKD(+)1例；而16異常核型患者FLT3-ITD(+)1例(6.25%)，FLT3-TKD(+)2例(12.5%)。FLT3-ITD基因突變在正常核型發生率高于異常核型，但兩者差異無統計學意義。1例FLT3-ITD基因突變異常核型為t(15;17)，2例發生FLT3-TKD突變的異常核型AML患者中分別是inv(16)和t(15;17)。

2.4 FAB亞型分析 FLT3基因突變可發生FAB的多個亞型，5例FLT3-ITD(+)患者中M1、M2、M4、M5、M6各1例，3例FLT3-TKD(+)患者中M3、M2、M4各1例。

2.5 臨床特征分析及預后 排除FLT3-TKD(+)干擾，將患者按FLT3-ITD突變情況分為FLT3-ITD(+)、FLT3-ITD(-)兩組進行分析，各組臨床數據見表1。與FLT3-ITD(-)組相比，FLT3-ITD(+)突變組患者初診時白細胞計數、血紅蛋白、血小板計數及骨髓原始比例均高于正常健康對照組，但差異無統計學意義。在發病年齡及性別比例上，FLT3-ITD(+)組患者發病年齡與正常健康對照組之間差異有統計學意義(P<0.05)。將可隨訪預后的30例患者分為FLT3-ITD(+)、FLT3-ITD(-)兩組，其CR率分別是40%(2/5)、68%(17/25)，中位隨訪時間9個月(1～18個月)。

3 討 論

AML是造血系統的具有細胞遺傳學和分子遺傳學的一種異質性疾病。在AML的發病中，細胞遺傳學改變是判斷預后的重要依據，往往出現染色體異常，有40%～50%的AML患者細胞遺傳學特征為正常核型。對于正常核型的AML，在診斷、預后分層和微小殘留病灶的監測是目前遇到的一大難題，因此，一些特征性基因突變對于亞型分類和預后評估有著重要的意義。FLT3是Ⅲ類酪氨酸激酶受體的一種，后者包括PDGF-R，KIT和FMS，并在造血祖細胞的早期增殖分化階段起重要作用。FLT3基因突變可導致配體獨立的二聚體形成和酪氨酸自磷酸化作用，進而激活其下游RAS/MAPK，STAT5和PI3K/AKT異常的信號轉導途徑，促進細胞增殖和抑制凋亡，推測其與AML的發生及復發有關。

目前，多項研究顯示，FLT3基因，尤其是ITD突變與AML患者的臨床表現及預后相關[1-3]。本研究在50例AML患者中共檢出FLT3-ITD(+)5例(10%)，FLT3-TKD(+)2例(4.0%)，發生率較文獻[1,2]報道少，可能與樣本量少及瓊脂糖電泳檢測方法敏感度有關。本研究結果也顯示，正常核型AML患者FLT3-ITD(+)檢出率20%，高于異常核型(6.25%)，與正常健康對照組相比，FLT3-ITD(+)突變患者初診時白細胞計數、血紅蛋白及骨髓原始細胞比例均高，緩解率低，預后差，在發病年齡及性別比例上無明顯差異，與其他研究結果一致[3-5]。有學者認為，伴有FLT3-ITD(+)突變的AML患者的總生存期(OS)、無病生存期(DFS)均縮短[6]。由于隨訪時間較短，本研究未作此方面的統計。FLT3-TKD突變的預后影響還處于爭議中，Mead A等[7]報道年輕AML患者FLT3-TKD突變多伴白細胞增高，但在具預后差、細胞遺傳學異常的AML患者中罕見，本研究與此報道一致。

本研究分析，FLT3-ITD(+)、FLT3-ITD(-)兩組CR率結果顯示，FLT3-ITD(+)AML的CR率較FLT3-ITD(-)AML患者低。與國外研究結果一致[6]。LT3突變在原發性AML，尤其是正常核型AML患者中有著較高的發生率。已有文獻[8]報道，FLT3-ITD(+)患者單獨使用化療療效較差(合并NPM1突變以及FLT3突變等位基因比例較低的療效較好)，FLT3-ITD(+)患者首次完全緩解后早期(而不是在進行多次鞏固化療后)行異基因造血干細胞移植是最佳的選擇，與化療或自體造血干細胞移植相比，能夠使無病生存期延長3～5年，并降低復發率。針對FLT3基因突變的靶向治療已逐步應用于臨床[9]，為診斷和治療AML提供了新的手段和策略[10]。因此，臨床上篩查FLT3基因突變對AML患者治療及預后均有指導意義。

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(2013-11-28收稿 2014-01-16修回)

(責任編輯 郭 青)

EffectofFLT3genemutationsonacutemyeloidlecukemia

ZHU Baigui1, ZHANG Sujiang2, and LI Jianyong2. 1.Department of Hematology, Jiangsu Provincial Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Forces, Yangzhou 225003, China. 2. Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University， Nanjing 210029, China; 3.Department of Respirqtory, 263 Hospital Clinical Division General Hospital of Beijing Military Command, Beijing 100700, China

ObjectiveTo study the influence of FLT3 gene mutation on acute myeloid leukemia(AML).MethodsWe used PCR combined with direct sequencing and cloning sequencing to investigate FLT3 mutation in 50 AML patients, and further analyzed clinical data of these patients.ResultsFLT3-ITD mutation was found in 20% AML patients with normal karyotype, which was higher than that in patients with abnormal karyotype. Compared with wild-type group, the WBC count, hemoglobin and blast cells in bone marrow were all high in FLT3-ITD positive group which with lower CR ratio.ConclusionsFLT3 mutation is the major molecular marker of AML patients with normal karyotype, which is very important for prognosis analysis and targeted therapy of AML.

FMS-like tyrosine kinase3; acute myeloid leukemia; mutation

朱柏貴，本科學歷，主任醫師，E-mail：zhubogui@163.com

1.225003揚州，武警江蘇總隊醫院血液科；2.210029，南京醫科大學第一附屬醫院血液科；3.100700，北京軍區總醫院263臨床部呼吸科

高鴻敏，E-mail: gaohongmin1975@126.com

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