SiO2粉塵刺激對NR8383細胞分泌炎癥因子的影響

王發選，許紅霞，張洋，楊婷，黃程君，任曉慧，蘭亞佳，張勤

(1.寧夏醫科大學公共衛生學院勞動衛生教研室，寧夏 銀川 750004；2.四川大學華西公共衛生學院勞動衛生教研室，四川 成都 610041；3.上海市浦東區疾病預防控制中心，上海 200136)

迄今為止，矽肺的發病機制尚不完全清楚，多年的研究發現肺泡巨噬細胞與SiO2相互作用而產生的諸多因子在矽肺發生發展過程中起到關鍵性作用[1]。肺泡巨噬細胞(AM)是生物體抵御外來微生物入侵的天然屏障，是機體固有性免疫系統中重要的效應細胞。AM位于肺泡腔及微小氣道內，是肺組織內重要的常駐細胞和防御細胞。除發揮吞噬防御功能外，還可通過分泌大量的細胞因子啟動和調節局部的免疫炎癥性反應。在矽肺發病機制的各種學說中，巨噬細胞受損是其中重要機制[2]。本研究采用大鼠肺泡巨噬細胞系NR8383細胞為研究對象，通過不同劑量粉塵刺激細胞，分析炎癥因子的表達情況，為后續矽肺發病機制的體外研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株

NR8383大鼠肺泡巨噬細胞株，購于中國科學院上海細胞所。

1.2 主要試劑及儀器

標準石英粉塵(SiO2純度99%，粒子大小范圍在0.5～10 μm，80%的粒子直徑在1～5 μm之間，Sigma 公司，美國)、MTT(Sigma 公司，美國)、RNA store液、瓊脂糖、DNA Ladder、6×Loading Buffer、Green view(天根生化，中國)、TRIZOL試劑(Life science，美國)、異丙醇、氯仿(成都科華試劑，中國)，反轉錄試劑盒，Realtime qPCR試劑盒、RNase-free水(Takara公司，日本)、qPCR 引物(上海生工生物工程公司)。

SW-CJ-2FD型雙人單面超凈工作臺(蘇州凈化，中國)，-80 ℃冰箱、純水儀(Millipore 公司，美國)，高速低溫離心機(Thermo Fisher公司，美國)，凝膠成像分析系統、普通PCR儀、實時熒光定量PCR儀CFX96(Bio-rad公司，美國)，紫外分光光度儀(島津公司，日本)，電泳儀、電泳槽(北京六一，中國)。

1.3 細胞常規培養

復蘇NR8383細胞，用含有15%FBS的Ham’S F12K細胞培養液培養，接種密度以1×105/mL為宜，置37 ℃，5%CO2培養箱培養，每三天更換一次培養液。一般4～6 d長滿，按照1：3傳代。NR8383細胞為半貼壁細胞，一部分細胞懸浮生長，一部分貼壁生長。傳代時將懸浮細胞輕輕吹打下來，轉入離心管中，貼壁細胞加入少量胰蛋白酶消化約1 min，含血清培養基終止消化后，輕輕吹打，一起將細胞轉入離心管中，1 000 rpm離心5 min，棄上清，加新鮮培養液將細胞沉淀重懸細胞，然后接種到新瓶或培養板中。實驗選用細胞為對數生長期、0.2%臺盼藍拒染率>95%的細胞。

1.4 NR8383細胞在粉塵刺激下細胞活力的改變

取生長狀態良好的細胞，用15%FBS的F12K完全培養液配成單個細胞懸液，以每孔3×104個細胞接種于96孔培養板，每孔100 μL溶液。將接種后的96孔板放入5%CO2、37 ℃細胞孵箱內培養24 h。然后加入終濃度為5 μg/cm2、10 μg/cm2、20 μg/cm2、40 μg/cm2、80 μg/cm2的粉塵懸液，繼續培養12 h，于終止培養前每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，37 ℃溫育4 h后吸去培養上清液，每孔加入DMSO 200 μL終止反應，振蕩10 min，全自動酶標檢測儀測定各孔的光密度OD值。實驗波長為490 nm，每組設8個復孔，以不加細胞只加培養液的為空白組，而只加培養液不予任何試劑干預的細胞為對照組，按下列公式計算細胞存活率：

細胞存活率=(實驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%

1.5 NR8383細胞在粉塵刺激下形態學改變

取生長狀態良好的細胞，用15%FBS的F12K完全培養液配成單個細胞懸液，以每孔103～104個細胞接種于96孔培養板，每孔100 μL溶液。將接種后的96孔板放入5%CO2、37 ℃細胞孵箱內培養24 h。將培養板置于顯微鏡下觀察粉塵刺激后各組細胞的形態學變化。

1.6 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)

取生長狀態良好的細胞，用15%FBS的F12K完全培養液配成單個細胞懸液，以每孔6×105個細胞接種于6孔培養板，每孔2 mL溶液。將接種后的96孔板放入5%CO2、37 ℃細胞孵箱內培養24 h。然后加入終濃度為100 μg/cm2、20 μg/cm2、40 μg/cm2的粉塵混懸液，繼續培養12 h，吹打細胞，轉移至離心管中，1 000 rpm離心5 min。TRIZOL法提取離心后細胞的總RNA，利用紫外分光光度計測定總RNA的純度和濃度，瓊脂糖凝膠電泳法檢測總RNA的完整性。采用Takara公司的反轉錄試劑盒按照說明書配制反轉錄體系，反轉錄條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 10 min，合成cDNA。根據大鼠TNF-α，IL-1β，TGF-β和β-actin mRNA全長序列采用Primer5.0軟件進行引物設計(表1)。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。按照說明書配制RT-qPCR反應體系，采用兩步法RT-qPCR反應程序：95 ℃ 30 s，95 ℃5 s，60 ℃ 30 s，40個循環，后制作溶解曲線確定產物的特異性，然后用瓊脂糖凝膠電泳法鑒定PCR產物。基因相對表達量用RQ值表示，RQ=2-△△Ct，其中△△Ct=△Ct目的基因-△Ct對照，△Ct目的基因=Ct目的基因-Ct內參基因，△Ct對照=Ct對照組目的基因-Ct內參基因。

表1 TNF-α，IL-1β，TGF-β基因引物

1.7 統計學分析

利用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，各組細胞存活率比較采用方差分析，組間比較采用SNK法。對TNF-α，IL-1β，TGF-β基因的表達數據進行統計描述，利用成組設計的秩和檢驗分析各組差異，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態學觀察

常規培養細胞：細胞為半貼壁細胞，部分貼壁，部分不貼壁，不貼壁的細胞成簇狀，晃動培養基后，發現簇狀細胞會游動。細胞呈圓形，遮光性好(圖1A)。

染塵細胞：同樣為半貼壁細胞，高倍鏡下可觀察到細胞內吞噬有許多細胞顆粒(箭頭所示)，遮光性強。在培養瓶底還看見許多未被細胞吞噬的粉塵顆粒(圖1B)。

2.2 NR8383細胞在粉塵刺激下細胞活力的改變

不同劑量粉塵刺激NR8383細胞后，隨著染塵劑量的增加，細胞存活率均有不同程度的降低，以80 μg/cm2組降低最為明顯，其他各組與80 μg/cm2組比較，差異均具有統計學意義(P<0.05)。其余各組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)

表2 MTT法測定SiO2粉塵對NR8383細胞存活率的影響(n=8)

*P<0.01，與80 μg/cm2組比較。

2.3 總RNA的質量

利用紫外分光光度計測定，各樣品的OD260/OD280>1.9。表明提取RNA的純度、濃度質量合格，可以用于后續實驗。各樣品瓊脂糖凝膠電泳圖譜5 s、18 s和28 s條帶較清晰(圖2A)，可以用于后續實驗。

2.4 Realtime-qPCR結果

各染塵組細胞TNF-α，IL-1β，TGF-β的mRNA相對表達水平均高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)。隨著染塵劑量的遞增，TNF-α，IL-1β，TGF-β的mRNA相對表達水平逐漸增高。

表3 各染塵組與對照組TNF-α，IL-1β，TGF-β的mRNA相對表達水平

*P<0.05，**P<0.01，與對照組比較；#P<0.05， ##P<0.01，與10 μg/cm2組比較；△P<0.05，與20 μg/cm2組比較。

2.5 Realtime-qPCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果

TNF-α，IL-1β和TGF-β的擴增產物均為一條清晰條帶，與DNA Ladder相比，基因TNF-α擴增產物的長度介于100～150 bp之間。基因IL-1β擴增產物的長度介于200～250 bp之間，基因TGF-β擴增產物的長度介于50～100 bp之間，接近100 bp，基因IFN-γ的產物長度介于50～100 bp之間，兩者均與設計引物的產物長度相一致(圖2B)。

3 討論

既往用于矽肺機制研究體外研究的肺泡巨噬細胞主要是通過大鼠支氣管肺泡灌洗獲得。其制備和純化方法繁瑣，收獲細胞量少且容易污染，體外培養存活時間短，且傳代多次后，細胞增殖能力明顯降低，應用比較局限。所以后來的研究中多采用小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7細胞系，人單核細胞株(THP-1細胞)和大RAW264.7鼠肺泡巨噬細胞株(NR8383細胞)來代替原代肺泡巨噬細胞培養，而在這三種細胞系中，真正來源于肺組織的細胞系只有NR8383細胞一種。其中人類單核細胞系THP-1細胞用于體外研究時，只有經佛波酯(PMA)刺激后，可分化為巨噬細胞[3]，分化后的細胞才具有與人肺泡巨噬細胞相似特性[4-5]，所以應用也比較局限。

大鼠肺泡巨噬細胞系NR8383細胞是正常大鼠肺泡巨噬細胞在特定條件下培養數代后形成的細胞系，具有正常AM的生物學特征[6]。NR8383細胞系能夠提供研究肺泡巨噬細胞適合的試驗系統，能夠對外在刺激產生相應的反應，可以產生多種細胞因子，可用于體外肺泡巨噬細胞相關功能和肺部炎癥的研究[7-8]。在本研究中，我們選擇不同劑量游離二氧化硅粉塵刺激NR8383細胞，采用熒光定量PCR法檢測不同劑量粉塵刺激后細胞分泌炎癥因子的變化情況，結果發現NR8383細胞在接受粉塵刺激后，分泌的炎癥因子量明顯增加，提示NR8383細胞可以作為后續矽肺發病機制研究，尤其是免疫機制研究中應該優先選擇的實驗材料。體外研究很好的研究對象。

在矽肺發病機制的各種學說中，炎癥反應學說一直占據著主導地位，炎癥因子的變化是粉塵致機體損害的早期反應。粉塵進入呼吸道以后，由于其機械刺激作用，巨噬細胞作為最早反應的靶細胞，吞噬石英粉塵顆粒后被活化，釋放各種前炎癥因子(IL-1β、TNF-α、IL-6)，介導炎性和纖維化過程[9-10]。同時這些因子可誘導其他單核細胞向炎性部位聚集，擴大炎性反應的范圍和程度[11]。長期以來我們只關注這些因子對下游其他細胞的影響，實際上像IL-1β這些炎癥因子有明顯的自身反饋調節作用，進而引發炎癥反應的放大效應，在各種急慢性非感染性炎性疾病和肺纖維化過程中發揮著重要的作用[12-13]。這可能是粉塵刺激巨噬細胞后分泌炎癥因子增多的主要機理。

本研究采用大鼠肺泡巨噬細胞株(NR8383細胞)作為研究對象，分析粉塵刺激12 h后各種炎癥因子的變化，明確這些炎癥因子的作用可為矽肺發病機制的研究提供一定的思路，進而通過調控這些炎癥因子，來干預介導矽肺發生發展進程，可能給矽肺的纖維化干預甚至治療帶來新希望。由于本研究只設置了三個劑量，而且只做了染塵12 h后各種炎癥因子的變化，未能動態反映粉塵作用于細胞后，不同時間點各種細胞因子的動態變化。這些因子的產生機理以及在矽肺發病和纖維化進程中發揮何種作用有待深入的功能學研究。

【參考文獻】

[1] Rimal B，Greenberg AK，Rom WN．Basic pathogenetic mechanisms in silicosis：current understanding [J].Current opinion in pulmonary medicine，2005，11(2)：169-173.

[2] Zhai R，Ge X，Li H，et al．Differences in cellular and inflammatory cytokine profiles in the bronchoalveolar lavage fluid in bagassosis and silicosis[J].American journal of industrial medicine，2004，46(4)：338-344.

[3] Park E，Jung H，Yang H，et al．Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli [J].Inflammation Research，2007，56(1)：45-50.

[4] Chen F，Kuhn DC，Gaydos LJ，et al．Induction of nitric oxide and nitric oxide synthase mRNA by silica and lipopolysaccharide in PMA-primed THP-1 cells [J].Apmis，1996，104(1-6)：176-182.

[5] 毛國根，葉少菁．單核細胞株在矽肺體外研究中的應用 [J].中華預防醫學雜志，2000，34(5)：274-277.

[6] Helmke RJ，German VF，Mangos JA．A continuous alveolar macrophage cell line：comparisons with freshly derived alveolar macrophages [J].In vitro cellular & developmental biology，1989，25(1)：44-48.

[7] Ghiazza M，Scherbart AM，Fenoglio I，et al．Surface iron inhibits quartz-induced cytotoxic and inflammatory responses in alveolar macrophages [J].Chemical research in toxicology，2010，24(1)：99-110.

[8] Krieg DP，Helmke RJ，German VF，et al．Resistance of mucoid Pseudomonas aeruginosa to nonopsonic phagocytosis by alveolar macrophages in vitro [J].Infection and immunity，1988，56(12)：3173-3179.

[9] Piguet PF，Collart MA，Grau GE，et al．Requirement of tumour necrosis factor for development of silica-induced pulmonary fibrosis [J].Nature，1990，344(6263)：245-247.

[10] Lang DS，Schocker H，Hockertz S．Effects of crocidolite asbestos on human bronchoepithelial-dependent fibroblast stimulation in coculture：the role of IL-6 and GM-CSF [J].Toxicology，2001，159(1)：81-98.

[11] Liu H，Zhang H，Forman HJ．Silica induces macrophage cytokines through phosphatidylcholine-specific phospholipase C with hydrogen peroxide [J].American journal of respiratory cell and molecular biology，2007，36(5)：594.

[12] Dinarello CA．A clinical perspective of IL-1β as the gatekeeper of inflammation[J].European journal of immunology，2011，41(5)：1203-1217.

[13] Arend WP，Palmer G，Gabay C．IL-1，IL-18，and IL-33 families of cytokines[J].Immunological reviews，2008，223(1)：20-38.