豬瘟活疫苗（兔源）組織毒生產及其貯存方法比較研究

魯立柱/新疆農業大學動物醫學學院 王燕平/新疆天康畜牧生物技術股份有限公司制藥事業部

豬瘟活疫苗（兔源）組織毒生產及其貯存方法比較研究

魯立柱/新疆農業大學動物醫學學院 王燕平/新疆天康畜牧生物技術股份有限公司制藥事業部

我國自1956年開始推廣豬瘟兔化弱毒疫苗時，首先是取家兔的淋巴結和脾組織就地制造的濕苗， 隨制隨用。1958年研制成功冷凍干燥疫苗，適用于工廠化生產，時至今日仍然采用相同的生產工藝，豬瘟脾淋苗以其抗原性好，過敏率低，免疫后快速產生免疫力等優點深受廣大養殖戶的喜愛，但其組織毒生產工藝繁瑣，人員工作量大，綜合成本高等諸多缺點也限制了其產量。通過對生產經驗的總結，從降低測溫次數、提高組織收獲量、增加組織保存期限三方面著手，降低生產成本，提高組織毒生產安排的靈活性，以達到保證產品質量的基礎上有效提高疫苗產量的目的。

一、材料與方法

1. 材料。豬瘟病毒：豬瘟兔化弱毒，F0代豬瘟兔化弱毒（C株）凍干種毒購自中國獸藥監察所提供；脾淋組織毒由本公司豬瘟生產組提供。試劑：注射用水，由本廠制水站提供；滅菌生理鹽水、Hank's液、5%蔗糖脫脂牛奶和豬瘟耐熱保護劑等自行配制，消毒后備用。實驗動物：體重為2.0～2.5 kg健康的純系加利福尼亞兔，未注射過兔瘟疫苗，基礎體溫應在39.3℃～39.7℃之間，且波動小于0.5℃，由新疆鄯善縣綠洲兔業養殖場提供。

2.方法。

（1）生產病毒最佳接種量和收毒部位的確定方法。先將凍干毒種用滅菌生理鹽水制成50倍稀釋的乳劑，耳靜脈注射家兔6只，每只1 ml。注射后按照規程規定的效力檢驗方法，選取熱型反應為定型熱的家兔3只，在溫度下降后24 h內剖殺，以無菌手術采取家兔肝臟、脾臟、腸系膜淋巴結、頜下淋巴結，采毒時切勿剪破胃、腸、食道，以免污染。然后，將收獲的組織分別碾磨，用滅菌生理鹽水稀釋成1×10-4、2×10-4、3×10-4兔體感染量/克的乳劑，耳靜脈注射家兔2只，每只1 ml，按照規程規定的效力檢驗方法判定家兔熱型。

（2）組織毒使用不同保護劑在不同溫度下的保存期試驗方法。將制備的兔瘟組織毒，稱重，研磨，平均分成四份，分別使用滅菌生理鹽水、Hank's液、5%蔗糖脫脂牛奶和豬瘟耐熱保護劑制備成10倍稀釋的乳劑。再以2.0×10-4兔體感染量/克作為實驗標準，將各組試驗樣用滅菌生理鹽水稀釋成2.0×10-4兔體感染量/克的乳劑，各組試驗樣分別置于-70℃、-15℃、2℃～8℃環境貯存，于7日、30日、60日、90日、120日、150日分別耳靜脈注射家兔2只，每只1ml。按照規程規定的效力檢驗方法判定熱型反應，檢查各試驗樣的基礎病毒含量是否≤2.0×10-4兔體感染量/克。

二、結果

1．脾臟、肝臟、腸系膜淋巴結、頜下淋巴結組織生產病毒的收率比較。實驗兔脾臟平均重量在2～3 g，在腹腔內胃大彎部，易于收獲，且無其它組織粘連，收獲中也不易產生污染，各方面條件都適用于組織苗的生產。肝臟質量大，平均在80～120 g是脾臟的2～40倍，而且收獲容易，不易造成污染，重量大是其最大的優勢，腸系膜淋巴結在腹腔內腸系膜中心位置，其平均重量在4～5 g，被大量脂肪組織包圍，收獲時不易剝離，不小心容易剪破腸道造成污染。頜下淋巴結位于皮膚與下頜骨之間，平均重量為0.3～0.5 g，體積過小收獲時不易剝離，而且在宰殺兔子時，放血過程中容易切破此部位造成污染。表略

2.各組織不同稀釋度熱型反應判定結果。按照規程效力檢驗的方法，檢測脾臟、腸系膜淋巴結、頜下淋巴結的病毒含量，經熱型判斷，結果良好，達到了生產要求的配苗標準，脾臟病毒含量最高，腸系膜淋巴結和頜下淋巴結稍低于脾臟，肝臟的病毒含量未達到生產配苗的要求。表略

3.各種保護劑保存的組織毒在不同溫度下保存7日、30日、60日、90日、120日、150日后的病毒含量保持情況。根據病毒含量測定結果，生理鹽水和Hank’s液保存的組織，只有在-70℃時能夠維持組織病毒含量到150日以上。-15℃保存組織，生理鹽水保存的組織病毒含量會迅速降低，Hank’s保存的組織病毒含量可以維持到60日，仍能達到配苗要求。豬瘟耐熱保護劑和5%蔗糖脫脂牛奶保存的組織病毒在冷凍保存下，保存時間能夠到達150 d以上。2℃～8℃冷藏保存，5%蔗糖脫脂牛奶保存的組織在第7日時病毒含量就已經不符合配苗要求了，豬瘟耐熱保護劑保存的組織可以維持到120 d以上。表略

4.四種保護劑優缺點對比。對四種保護劑從保存效果和經濟性、實用性方面對比分析，5%蔗糖脫脂牛奶，最適合在生產中使用，生理鹽水和Hank's液雖然經濟實惠，操作方便，對配苗影響也不大，對組織毒的保存效果不理想，不能達到長期保存組織毒的目的，豬瘟耐熱保護劑，對組織病毒含量保存的很好，但價格較高，且容易凝固影響配苗，所以在生產中不便于使用，5%蔗糖脫脂牛奶，保存效果良好，其本身就是凍干保護劑，對于產品后期配苗凍干過程無影響。表略

三、討論

豬瘟活疫苗(兔源)生產使用的組織毒，是熱型判定為定型熱反應和輕熱反應的家兔的脾臟和腸系膜淋巴結，組織毒配苗要求是每頭份疫苗組織含量不得少于0.01 g。每只家兔能夠收獲的組織量在7～8 g，按照配苗要求，每只家兔只能產出700～800頭份疫苗。如果提高家兔的組織收獲量，就能夠提高疫苗的產量。脾臟和腸系膜淋巴結重量是有限的，不可能有太多的改變，因此發現和收取其它含毒組織是提高收獲量的唯一途徑。從結果可以看出脾臟、腸系膜淋巴結和頜下淋巴結都出現了較好的熱型反應，達到了配苗要求。肝臟雖然重量較大，但病毒含量較低，未出現明顯的熱型反應，不能用于生產，頜下淋巴結的熱型反應達到了配苗要求，可以作為生產用組織毒，一定程度上達到提高產量的目的。但頜下淋巴結重量較小，收獲困難且容易造成污染，在大生產中為了收取這極少的一部分組織而冒著整批產品污染的風險，有些得不償失。所以綜上所述，脾臟和腸系膜淋巴結仍以病毒含量高，無菌收獲操作簡單等優點列為豬瘟活疫苗（兔源）生產的最佳組織原料。

根據生產要求，組織毒病毒含量≤2×10-4/克，方可用于配苗，豬瘟活疫苗（兔源）生產規程要求，新鮮組織毒存放時間不得超過15日。從實驗結果可以看出四種保護劑保存的組織毒，存放在-70℃的，至150日都可以達到有效的病毒含量，-15℃保存的組織毒中，生理鹽水組和Hank's液組在90日時病毒含量測定熱型不合格，已經不能用于配苗。2～8℃保存的組織毒，除耐熱保護劑組一直到120日仍然保持有效病毒含量外，其余三組于7日時病毒含量就已經不合格了。

分析以上結果，無論采取以上那種保護劑，貯存在-70℃的組織毒都能存放150日以上而不影響病毒含量，但在-70℃保存，限制性較大，成本高，不適于大生產使用，對于生產與檢驗用種毒應該是十分理想的保存溫度。

-15℃是生產冷庫普遍能夠達到的溫度，經濟實用，使用5%蔗糖脫脂牛奶和豬瘟耐熱保護劑的組織毒，在此環境下都能保存到150日以上且不影響病毒含量。豬瘟耐熱保護劑保存組織雖然在2～8℃環境下保存150日以上，但使用耐熱保護劑，成本較高，且耐熱保護劑內含有明膠，冷藏保存容易使組織在容器內結成整塊，不便于后期配苗使用，所以使用豬瘟耐熱保護劑，雖然能取得很好的保存效果，但生產中運用難度較大。

綜上所述使用5%蔗糖脫脂牛奶，在-15℃以下保存組織毒，在生產中應用，能取得最理想的效果，大大延長組織毒的保存時間。

略