卵巢切除聯合應用激素對綿羊股骨近端BMD及微觀結構的影響

劉達，張譯，謝慶云，廖冬發，陳俊，鄭媛，權毅，張波

(1.成都軍區總醫院骨科，四川 成都 610083；2.成都軍區總醫院附屬口腔醫院，四川 成都 610083；3.解放軍第37醫院，四川 雅安 625000)

2008年發布的《骨質疏松癥防治中國白皮書》指出，我國50 歲以上的人群中骨質疏松的總患病率為15.7%，而70%～80%的中老年骨折是因骨質疏松引起的，髖部骨折是最常見的骨折部位之一，每年新發髖部骨折病例為23萬。針對骨質疏松性髖部骨折的治療主要包括預防性藥物治療和骨折后的內固定手術治療[1，2]。而這些治療都需要以骨質疏松動物模型為基礎來進行研究，其中包括評價藥物對髖部骨密度及力學強度的作用和評價內固定植入物在局部的生物力學強度等相關研究。因此，采用合適的髖部骨質疏松動物模型是進行該領域研究的必要前提條件。

研究表明，綿羊髖部的解剖結構和力學分布與人體接近，且卵巢切除術(ovariectomy，OVX)后的綿羊可模擬婦女絕經后因雌激素水平下降而引起的骨密度(bone mineral density，BMD)及骨小梁結構的變化[3，4]。因此，越來越多的學者選用綿羊來建立骨質疏松大動物模型。目前的研究多集中在采用卵巢切除聯合應用激素的方法來建立綿羊骨質疏松模型，但大部分的研究集中在對綿羊腰椎BMD及微觀結構的變化進行了評價[5-7]，缺乏對綿羊髖部、尤其是股骨近端BMD及骨組織微觀結構的變化的相關研究。因此，本實驗采用去勢手術聯合應用激素的綜合處理方法來建立髖部骨質疏松動物模型，通過雙能X線吸收骨密度儀測量、micro-CT分析和組織學觀察評價該建模方法對綿羊股骨近端的BMD及微觀結構的影響作用。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 10只健康成年雌性綿羊，年齡(4.5±0.5) 歲，體重(55.0±6.4) kg，均已過生育哺乳期，由成都軍區總醫院實驗動物中心提供。

1.2 實驗器材 手術室及術中所需器械均由成都軍區總醫院實驗中心提供。雙能X線吸收骨密度儀(Lunar Corp，Madison，WI，USA)由成都軍區總醫院門診部提供。eXplore Locus SP型Micro-CT (Healthcare，GE，USA)，輪轉式硬組織切片機(Leica-LA 2 500，Germany)，全自動顯微鏡(Leica-LA，Germany)，均由西京醫院全軍骨科研究所提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組、BMD的測量及手術 將所有綿羊隨機分為實驗組(n=5)和假手術組(n=5)。肌注速眠新Ⅱ(解放軍獸醫大學軍事獸醫研究所生產)(0.1 mL/kg)麻醉成功后，將綿羊側臥于雙能X線吸收骨密度儀的掃描臺上，采用手動分析模式測定股骨近端感興趣區域(ROI)的BMD(見圖1)，從股骨頭下、沿股骨頸方向取矩形的ROI，其寬度接近股骨頸的寬度，長度為從股骨頭下到股骨外側皮質。測量BMD之后將綿羊仰臥于手術臺上，術區常規消毒鋪單后，切開皮膚及皮下組織，假手術組僅顯露雙側卵巢，實驗組行雙側卵巢切除術。術后1月開始肌肉注射甲基強的松龍(0.45 mg/kg/d)，每月定期測量一次綿羊體重，根據體重調整注射劑量。連續注射10個月，最后1個月內逐漸減量至停止。停藥后觀察1個月再次使用相同方法測量雙側股骨近端的BMD。注射激素期間，所有綿羊常規飼養。觀察傷口愈合情況、注射部位感染情況及注射期間和停藥后有無不良反應。

圖1 股骨近端感興趣區域的BMD測量

1.3.2 椎體標本的制備 去勢手術后1年，處死所有綿羊。取出雙側股骨，剔除所有的肌肉及韌帶。臺鉗夾持固定股骨，于股骨頭下垂直于股骨頸的軸向將股骨頭鋸斷，用內徑為15 mm的自制環鉆于股骨頸斷面中央、順股骨頸的軸向方向鉆取標本直至鉆透股骨近端外側皮質，保持低速轉動并用生理鹽水保持標本濕潤，盡可能減少因發熱而導致組織變性(見圖2)。將標本制成上下面平行、高度為30 mm、直徑為15 mm的圓柱狀股骨近端松質骨標本。所有標本用鹽水紗布包裹，密封于塑料袋中存儲于-20℃的條件下。實驗前所有標本均在室溫下自然解凍。

1.3.3 椎體標本的micro-CT分析 在44 mm_tube_21μm_270 min_ss的條件下對標本進行micro-CT掃描和重建。設定重建閾值為1 000，采用Advanced Bone Analysis軟件(GE Healthcare，USA)進行骨組織計量學分析。軟件自動生成的主要空間參數包括：a)骨體積分數(bone volume fraction，BVF)，即骨小梁的體積除以選中區域的總體積，以%表示；b)骨表面積體積比(bone surface/bone volume，BS/BV)，即骨小梁的表面積除以骨的體積，以mm-1表示。c)骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)以μm表示；d)骨小梁數目(trabecular number，Tb.N)，以mm-1表示；e)骨小梁間隙(trabecular spacing，Tb.Sp)，以μm表示。

圖2 股骨近端骨組織的鉆取

1.3.4 椎體標本的組織學觀察 將標本用10%中性福爾馬林固定5 d，不脫鈣。依次經70%、80%、90%、99%、100%的乙醇進行脫水(各18 h)。然后依次浸泡塑料液，包埋后固化成塊。使用輪轉式硬組織切片機，垂直于標本的長軸方向將骨組織切成厚度約30～50μm的切片。對切片進行麗春紅三色染色，使用全自動顯微鏡觀察標本的骨質情況。

2 結 果

2.1 大體觀察 術后所有綿羊活動和進食情況正常，未發生手術并發癥。術后所有切口均無紅腫滲出，10 d后均甲級愈合。注射部位的皮膚均無感染跡象，注射期間和停藥后所有綿羊均未見異常反應。

表1 兩組綿羊股骨近端BMD測量結果

2.2 綿羊股骨近端BMD 如表1所示，手術前兩組股骨近端平均BMD之間的差異無統計學意義(P=0.883)。假手術組手術前后的平均BMD無顯著變化(P=0.103)。實驗組術后的平均BMD較術前顯著下降，差異具有統計學意義(P=0.000)，下降平均為31.7%。且術后實驗組的平均BMD顯著低于假手術組，差異具有統計學意義(P=0.013)。

2.3 micro-CT分析 通過micro-CT三維重建發現，假手術組中骨小梁數量較多，骨小梁之間連接較密集，具有較好的空間結構；而實驗組中的骨小梁數量明顯少于假手術組，骨小梁之間排列稀疏，局部多見骨小梁連接中斷，空間結構明顯差于假手術組(見圖3)。對骨組織進行骨計量學分析，實驗組的BVF、Tb.Th和Tb.N顯著低于假手術組，差異均具有統計學意義(P<0.05)；BS/BV和Tb.Sp顯著高于假手術組，差異均有統計學意義(P<0.05，見表2)。

圖3 兩組綿羊股骨近端標本micro-CT三維重建

2.4 椎體的組織學觀察 對骨組織切片進行麗春紅三色染色后發現(見圖4)，假手術組中骨小梁數量多，排列密集，連續性好，骨小梁相互之間連接形成典型的髓腔結構。與假手術組相比，實驗組中骨小梁的數量明顯減少，排列更為稀疏，可見多處的骨小梁斷裂，小梁之間的連續性差，典型的髓腔結構較少見。

表2 兩組綿羊股骨近端標本空間參數的比較

a 假手術組16倍鏡下組織學觀察 b 實驗組16倍鏡下組織學觀察 c 假手術組50倍鏡下組織學觀察 d 實驗組50倍鏡下組織學觀察

3 討 論

我國是一個人口老齡大國，骨質疏松性骨折的發病率日益增加。屈波等[8]對成都地區2 457 例老年人骨質疏松性骨折發病特點進行分析，發現髖部骨折所占比例最高為37%。郝永強等[9]對上海地區5 923 例骨質疏松性骨折的發病特點研究分析顯示：髖部骨折占22%，脊柱骨折占8%。而髖部骨折骨壞死率及不愈合率高，約20%～40%可造成股骨頭缺血性壞死，50%患者可導致畸形，從而影響下肢功能，甚至因為臥床容易發生墜積性肺炎、泌尿系感染、褥瘡、下肢靜脈血栓形成等并發癥，病死率高，社會經濟負擔重。因此如何積極、有效的預防和治療髖部骨折已經成為臨床醫生面臨的一個難題。而相關的藥物治療及股骨近端骨折內固定的研究必須以骨質疏松動物模型為基礎來進行，因此良好的髖部骨質疏松動物模型是上述研究的前提條件。

目前，學者們進行了多種骨質疏松動物模型的研究。小鼠和大鼠等嚙齒類動物缺乏Haversian系統，且體積過小，不適合進行骨組織結構及力學特性的研究。犬類動物與人類的生理周期差別較大，且月經期沒有性激素的波動，卵巢及子宮切除后并不能誘導明顯的骨量丟失[10]。靈長類動物在生理周期和骨骼結構上與人類接近，很適合作為骨質疏松的動物模型。然而，它們飼養管理要求高，實驗操作危險大，費用昂貴；再加上醫學倫理道德的原因，該模型的獲取和使用均受到很大的限制，因此也不適合建立骨質疏松動物模型。近年來，使用綿羊建立骨質疏松動物模型得到了很多學者的青睞。研究表明：綿羊性情溫順，易于管理和飼養；價格較便宜，可大量購買；自發性排卵，激素分泌與女性類似；年老的綿羊(7～9 歲)可見哈佛系統的重建；且成年綿羊髖部解剖結構及力學分布與人體接近[3，4]。因此，綿羊是適合進行髖部骨質疏松動物模型的建立及內固定穩定性的相關研究。

Augat等[5]發現，OVX聯合糖皮質激素注射6個月后，松質骨的BMD和骨小梁體積分別降低了27%和34%；12個月后兩者分別降低了33%和37%。而僅行OVX處理對上述指標均無明顯降低作用。Schorlemmer等[6]對行OVX后的綿羊持續注射甲強龍(0.45 mg/kg·d)6個月后發現，該方法使皮質骨和松質骨的生成顯著減少，皮質骨的厚度顯著降低；1年后松質骨的生成和松質骨的BMD分別下降了38%和34%。Lill等[7]通過比較多種建模方法后發現：6個月后，OVX聯合甲強龍組中橈骨遠端皮質骨和松質骨的BMD分別降低了12.9%～20.3%和29.6%～32.4%；而OVX聯合低鈣飲食組中皮質骨和松質骨的BMD僅降低了3.9%～5.5%和7.1%～7.4%。目前的研究對髖部周圍、尤其是股骨近端骨質條件及微觀結構的評價甚少。

因此，針對這些不足，本研究采用目前常用的卵巢切除聯合應用激素的建模方法，在評價股骨近端BMD變化的基礎上，采用micro-CT技術和組織學觀察來評價該方法對綿羊股骨近端微觀結構的影響作用，進一步評價該方法建立髖部骨質疏松動物模型的效果。借鑒WHO關于人骨質疏松的診斷標準[2]，以BMD下降25%作為評價模型是否成功建立的標準。本實驗中，通過去勢手術聯合激素注射綜合處理12月后，綿羊股骨近端的BMD較前有顯著的下降(P<0.05)，且平均下降大于25%(31.7%)。通過micro-CT分析和組織學觀察，卵巢切除聯合應用激素后綿羊股骨近端的骨小梁數量顯著減少，骨小梁斷裂增多，骨小梁間隙增大，失去典型的髓腔結構，骨組織空間結構變差，局部骨質條件顯著下降。

通過研究我們認為，卵巢切除聯合應用激素的方法可以顯著降低綿羊股骨近端的BMD，顯著破壞綿羊股骨近端的微觀結構，顯著降低局部的骨質條件。卵巢切除聯合應用激素的方法可用于建立髖部骨質疏松動物模型。

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