一個水稻白化致死突變體abl25鑒定及其基因定位

朱環環, 劉艷霞, 潘倩文, 鄭凱倫, 林冬枝,2, 董彥君,2

(1.上海師范大學 生命與環境科學學院, 上海200234; 2.上海師范大學 植物種質資源開發中心, 上海 200234)

0 引 言

葉綠體是個半自主細胞器,它不僅是光合作用的重要場所,而且還負責各種代謝物的生物合成和儲存[1],一個具有光合活性的葉綠體的生成,需要光、質體和核基因組的控制,并伴隨著類囊體膜的產生[2-3].越來越多的證據表明,葉綠體的生成是個高度被監管的過程,包括基因表達,蛋白生物合成以及選擇性的蛋白質降解[4].所以,當葉綠體的發育受到阻礙的時候,會影響葉綠素合成,從而引起葉色異常[5-6],甚至導致植株死亡[7].很多與葉綠體相關水稻突變體已經被發現,并根據不同的表型被命名為virescent (v),stripe (st),albino,chlorina,zebra,and yellow-variegated[8].在這些突變體中,v突變體在葉片生長早期表現為葉綠體不足,在后期生長中會產生大部分的綠色葉片[9].St為條紋狀葉片突變體;chl突變體會產生淡綠色苗,是由于葉綠素的合成出現了問題[10];至于zebra和 yellow variegated突變體,發生后大都不會導致它們的死亡.而水稻白化苗(albino),葉片一產生就發生白化,大多數在三葉期枯死.關于水稻白化突變體的研究目前也取得一些進展,日本的Iwata[12-13]等報道的11個水稻白化突變體al1-al11,其突變基因位于第1,4,5,6號等染色體.夏久成等將一個返綠的白化突變基因al12,定位在第8染色體上[11].另外,通過白化致死突變體abl4 對研究,發現編碼的ABL4蛋白定位于類囊體膜,推測ABL4基因是葉綠體正常發育過程所必需的[14].余慶波等將水稻白化突變體alb21的突變基因定位在第3染色體,并發現其葉綠體中只有一些空泡狀結構[15];白化突變體osalb23被定位在第2染色體上[16].鞏孝帝[17]等水稻白化突變體asl1基因定在第1染色體,是編碼核糖體白蛋白基因突變引起.本研究發現并鑒定了一個水稻白化苗突變體abl25,它的白化致死表型不受溫度影響,對白化苗突變體的葉色表型、葉綠素水平,葉綠體超微顯微鏡進行觀察和分析,并利用了SSR及InDel分子標記對該突變基因進行了定位,為該基因的分子克隆及其作用機理的研究奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 材 料

突變體abl25從粳稻“嘉花1號”干種子經60Coγ射線輻照后代獲得.嘉花種子經過輻照之后發生突變(Aa),進行自交之后選取苗期分離出白化突變體的株系(上一代為雜合單株),隨機選取4株生長正常的單株掛牌,收獲掛牌的單株種子播種,根據后代分離情況確定上一代的基因型,棄純合野生型單株,保留雜合單株.之后,突變體雜合子與秈稻廣占63S雜交,得到F1代種子,自交后得到F2代分離群體,用于遺傳分析與基因定位.

1.2 方 法

1.2.1 突變體的表型觀察

為了進一步確定突變體abl25的表型,將突變體雜合子及其野生型嘉花1號的種子在32 ℃條件下催芽4 d后,播種在裝有水稻土的塑料盆內,因為有好多溫敏感的突變體被報道,為排除這種溫度差異,將abl25突變體放置在20、24、28、32 ℃的光照培養箱(GXZ智能型,寧波,江南儀器廠)內,每天12 h光照(光照強度為180 μmol/m2·s)和自然條件(25 ℃)下,進行培養,觀察突變體及其野生型葉色變化,并對其進行拍照.

1.2.2 葉片光合色素含量的測定

在上述32 ℃培養條件下,待突變體abl25與野生型嘉花1號長至3葉期時,參照沈偉其[18]描述的水稻葉片葉綠素浸提法.具體為取新鮮葉子1 g,加4倍的100%丙酮和少許石英砂進行在低溫下研磨,收集勻漿液;倒入10 mL離心管中3000 r/15 min低溫離心后取上清;若離心后沉淀物還呈現綠色則繼續研磨離心,直至離心后下層無綠色為止.所有的上清用80%丙酮定容至50 mL,然后測吸光值.然后使用BECKMANCOULTER-DU720分光光度計分別測定470、645、663 nm 3個波長下的吸光值,分別計算葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量,重復3次,取其均值.

1.2.3 葉綠體顯微結構觀察

取上述在32 ℃條件下生長3周的野生型與abl25突變體葉片,用2.5%戊二醛和l %四氧化鋨磷酸緩沖液4°下固定5 h后,用50%,70%,80%,95%,100%的乙醇和丙酮梯度下進行脫水,逐級脫5 min,最后用環氧化樹脂包埋樣品,切片后,經醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色后,Hitachi765型透射電鏡進行觀察和拍照.

1.2.4 構建定位群體

突變體雜合子(ABL25/abl25)與秈稻廣占63S雜交獲得F1種子,收獲單株種子播種,根據后代分離情況確定上一代的基因型,只保留雜合基因型(ABL25/abl25)的雜交種,獲得能用于遺傳分析F2代群體,選取表現為白化突變的單株提取DNA.

1.2.5 水稻DNA的提取

采用TPS法[19]以及CTAB[20]法,提取親本以及F2代遺傳群體基因組DNA.

1.2.6 基因定位

本研究中,首先選取本實驗室的保存SSR及InDel的分子標記檢測突變體abl25和廣占63S的多態性,然后選取均勻分布在水稻12條染色體上的有多態性的引物,然后,隨機挑選F2中分離出22株白化苗作連鎖分析,確定突變基因在那條染色體上,接著進一步擴大F2群體進行遺傳定位.在目標區域內通過 NCB公布的粳稻日本晴和秈稻9311的全基因組序列的差異InDel 位點,利用Primer Premier 5.0軟件設計引物[引物由上海生工生物工程技術服務公司合成](表 2),對突變基因進行進一步定位,應用MAPMAKER/EXP3.0[21]軟件,構建目的基因區域的遺傳圖譜.PCR反應體系包括:100 mmol/L Tris-HCl(pH=9.0)、100 mmol/L KCl、20 mmol/L MgSO4、80 mmol/L (NH4)2SO4、2.5 mmol/L dNTP、10 μmol/L引物、5 U/mLTaq酶和20 ng模板DNA.在Eppendorf 和東勝PCR儀上進行擴增,PCR反應程序為:94 ℃預變性4 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s(退火溫度隨不同引物變化),72 ℃延伸30 s,35個循環;72 ℃延伸10 min.反應產物用2.5%～3.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,經溴化乙錠染色后在UVP凝膠成像儀上成像,而對于多態性不明顯的引物的PCR產物,用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,銀染之后用冷光源膠片觀察燈觀察,并拍照記錄.

2 結果與分析

2.1 突變體的表型鑒定

在20,24,28,32 ℃人工氣候箱條件下以及自然條件下生長的突變體苗期表型均一致,不論發芽后首先長出的葉鞘,還是不完全葉,以及第2、3葉完全為白色,3葉期后,突變體逐漸死亡(圖1),表明突變體abl25葉色的變化不受溫度及其他外部條件所改變,是水稻苗期白化致死突變體.

圖1 abl25突變體的表型

2.2 突變體光合色素的含量變化

為了探究突變體中光合色素含量的變化,測定了野生型嘉花1號與突變型abl25的葉綠素,類胡蘿卜素的含量,結果顯示突變體abl25的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素的含量明顯低于正常水平,與野生型形成鮮明比對(表1),說明突變體中葉綠素的含量明顯降低,可能為葉綠素合成受到的影響而導致.

表1 abl25突變體的光合色素含量 (mg·g-1)

2.3 abl25葉綠體超細微結構的變化

通過透射電鏡觀察野生型嘉花1號與abl25突變體的葉綠體超微結構發現,野生型嘉花1號的葉綠體密度無明顯缺陷,可以看到井然有序的類囊體堆疊,而abl25突變體中無明顯的類囊體堆疊結構,只有些空泡結構(圖2).這說明葉綠體的發育受到嚴重阻礙,導致abl25葉片內沒有正常的葉綠體產生,葉綠素更是無法正常合成.

2.4 遺傳分析及基因定位

圖2 野生型和abl25突變體葉綠體的超微結構

選取22株F2代白化苗進行粗定位分析,發現水稻第2染色體上的分子標記RM424,RM475(圖3)有強烈的偏態擴增,因此,判斷abl25位于第2染色體,然后擴大群體198株(圖4A),將該基因定位在ID9047與 ID10317之間,其遺傳距離分別為0.8 和8.4 cM.為了精細定位目標基因區域,定位群體擴大至4700株,將突變基因定位在ID9111到ID9261之間,物理距離約為150 kb(圖4B),并發現ID9234與突變基因共分離.根據http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/和 http://rice.plantbiology.msu.edu在該區間跨越了2個不重疊的BAC (AP005777.2和AP005631.3)克隆群,預測包含23個候選基因.

圖3 分子標記RM424在親本(P1,P2)及22株具有突變表型F2代單株的DNA分離帶型

圖4 突變體基因abl25在水稻第2染色體上的定位

表2 本研究中新發展的有多態的分子標記

3 討 論

水稻不僅是重要的糧食作物,也是單子葉植物和禾本科的模式植物,水稻葉色突變體,越來越引起人們的研究興趣,但是只有很少一部分白化突變體能夠從分子水平作出闡釋.比如,水稻白化突變體alb21無完整的葉綠體結構,只是些空泡結構,其定位在第3染色體上1520 kb的區域內[14].同樣的,abl4白化致死突變體沒有成熟的葉綠體結構,只有些類似前質體的結構,以及部分囊泡狀結構,定位第4染色體210 kb內;目前較為詳細的是對白化突變體asl1的研究,表明asl1白化突變體是由編碼核糖體白蛋白基因突變引起[17].

到目前為止,與本研究abl25定位于同條染色體的已知突變基因有alb23[15],其葉綠體中無類囊體及其他顆粒,定位在280 kb的區間內;以及gra(t)[22],其在三葉期之前表現為白化苗,三葉期之后漸漸恢復綠色表型,定位于42.3 kb區間內.都與本文研究所確定在ID9111到ID9261之間150 kb內的位置完全不同,因此,abl25是一個新的白化突變基因.通過對ID9111到ID9261之間的生物信息學預測,發現其中共有23個候選基因,包括功能未知蛋白3個,其余20個編碼蛋白的基因中,通過前導肽預測顯示有1個葉綠體基因(LOC_Os02g16250)(http://ipsort.hgc.jp/),查閱水稻基因表達預測網站(http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/category-select.php)發現在葉片中高表達的基因有LOC_Os02g15660,LOC_Os02g15880,LOC_Os02g15900 LOC_Os02g16060,LOC_Os02g16250,通過對上述相關基因測序對比,顯示在野生型和abl25突變體中沒有差異,這說明上述候選基因可能與abl25白化致死無關.由于葉綠體自身所含有的蛋白或者定位于葉綠體以外的蛋白都可能影響植物葉綠體的正常發育[5].因此導致abl25白化致死的真正原因更是難以斷定,有可能不是葉綠體蛋白基因突變引起的.

本研究發現的abl25突變體,葉綠素和胡蘿卜素的含量大大降低(圖1),葉肉細胞超顯微電鏡觀察發現突變體葉綠體中無任何堆疊的類囊體結構,葉綠體的形態不正常(圖2),這都表明突變體的葉綠體形成在葉片發育過程中受到嚴重阻礙,導致葉綠素無法正常合成.更有趣的,定位過程發現在候選目標基因所在的9003～9234 kb區域之間,引物擴增的野生型DNA條帶非常清晰,而abl25突變體中暗淡或不清楚,推測ABL25基因的突變可能會對基因組的復制產生消極影響,影響突變體某些基因DNA的合成,類似現象在水稻virescent(v3)突變體到得證明[8],但對于abl25來說還需要進一步驗證.今后,將在此基礎上擴大定位群體,發展更多新的分子標記,進一步對該基因進行克隆和功能分析,將有助于加深對水稻苗期白化致死作用機理的了解.

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