重要秈型雜交稻親本“93-11”稻米食味品質的改良

竇蘭蘭,肖 璐,李建粵,2

(1.上海師范大學 生命與環境科學學院，上海 200234; 2.上海師范大學 植物種質資源開發中心, 上海 200234)

世界上有一半人口以稻米為主糧.近年來隨著生活水平的日益提高,人們對水稻稻米的品質要求也越來越高[1].影響稻米食味品質最主要因素是直鏈淀粉含量(AC)[2].有研究報道認為,稻米直鏈淀粉含量還與影響稻米柔軟程度的膠稠度指標也密切相關[3-4].

稻米直鏈淀粉合成主要受蠟質基因編碼的淀粉合成酶控制[5-6].目前已有較多報道顯示,導入水稻中的反義蠟質基因能夠降低稻米直鏈淀粉含量[7-12],以此達到改良水稻食味品質的目的.秈型水稻“93-11”由江蘇省里下河地區農科所培育而成.該品種目前在水稻生產中主要被用作兩系雜交稻的父本.在生產上大面積推廣應用的兩系雜交稻“兩優培九”、“廣兩優6號”等品種都是以“93-11”水稻為父本成功培育的.因此,利用轉基因技術導入反義蠟質基因降低“93-11”稻米直鏈淀粉含量,由此改善“93-11”稻米的食味品質研究將具有良好的應用前景．然而目前的研究顯示,秈稻為受體進行根癌農桿菌介導遺傳轉化,成功率相對較低[13].本實驗室曾構建含有雙份反義蠟質基因的表達載體:p13AWY-2[14],并成功轉化粳型兩系不育系水稻“261S”[15].

本研究以秈稻“93-11”和含有雙份反義蠟質基因的純合轉基因水稻株系“B3”為供試材料,利用雜交及多次與“93-11”水稻進行回交,并采用常規及分子標記輔助,選育出各種農藝性狀與“93-11”水稻接近,同時含有雙份反義蠟質基因的改良型“93-11”水稻.開展本研究可為改良以“93-11”水稻為父本的雜交稻食味品質奠定了基礎.

1 材料與方法

1.1 水稻親本材料

本試驗用親本水稻材料分別為秈稻“93-11”以及將只含有雙份反義蠟質基因、沒有抗性基因和報告基因的質粒載體(圖1)轉化粳型兩系不育系“261S”獲得的純合轉基因株系“B3”水稻[15].

圖1 含有兩份雙份反義蠟質基因質粒(p13AWY-2)載體結構

1.2 水稻植株DNA提取及反義蠟質基因的檢測

取水稻葉片,采用CTAB法提取葉片總DNA.參照楊瑞報道[15]合成檢測反義蠟質基因的引物.上、下游引物序列分別為:5′-CTCTCGGAGAGGTTCAGCTC-3′(YW5)和5′-CTTAATAACACATTGCGGACG-3′(YWf).PCR擴增反應程序為:94 ℃預變性5 min,94 ℃變性40 s,退火溫度55 ℃,30 s、72 ℃延伸45 s,共30個循環,最后72 ℃延伸10 min.采用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測.

1.3 改良后“93-11”水稻與對照農藝性狀和拷種分析以及糙米性狀考察

測量植株株高,記錄每株有效穗數,考察每穗總粒數、空粒數和實粒數,并計算結實率,稱量稻谷的千粒重和糙米重量;觀察含有反義蠟質基因植株糙米外觀;參考朱映東等報道[16],測量糙米體積.

1.4 改良后“93-11”水稻與對照糙米部分理化指標分析

取成熟種子的糙米,按照國標GB/T 15682—2008方法測定直鏈淀粉含量,按照國標GB/T 22294—2008檢測糙米膠稠度[17].

2 結果與分析

2.1 改良后“93-11”水稻培育過程及反義蠟質基因的檢測

以“B3”水稻為母本,“93-11”水稻為父本,進行雜交獲得F1代種子.以F1代植株為母本與“93-11”水稻回交,獲得BC1F1種子.在BC1F1植株種植期間,提取BC1F1植株葉片DNA,采用PCR檢測反義蠟質基因.將含有反義蠟質基因的BC1F1植株為父本,“93-11”水稻為母本又進行回交,獲得BC2F1種子.以同樣的方式將BC2F1植株為父本再與 “93-11”水稻回交2次,先后獲得BC3F1和BC4F1種子.在每次回交前也同樣采用PCR分析植株的反義蠟質基因,而且選取株型與“93-11”水稻盡量相似的植株進行目的基因的檢測和回交.在收獲BC4F1種子的同時,從含有反義蠟質基因的BC3F1植株上收獲自交BC3F2種子.繼續種植BC4F1種子和BC3F2種子,兩種對應植株小區種植編號分別為2011-59和2011-60.同樣取編號為2011-59和2011-60小區植株葉片,進行反義蠟質基因檢測,并以單株形式收獲兩類含有目的基因的2011-59(BC4F2)和2011-60(BC3F3)種子.

在采用PCR檢測回交植株的反義蠟質基因時,均選用原先轉化獲得“B3”水稻質粒(p13AWY-2)DNA為陽性對照,“93-11”水稻DNA為陰性對照.圖2分別顯示2011-59(泳道18～32)和2011-60(泳道3～17)兩種編號部分植株基因組DNA擴增反義蠟質基因的檢測結果.反義蠟質基因的PCR產物為650 bp,含有與p13AWY-2質粒相同分子量條帶的植株,表明其含有反義蠟質基因,而在“93-11”水稻中沒有相應的目的條帶(圖2).

M:100 bp DNA Marker; 1:p13AWY-2質粒; 2:“93-11”對照水稻; 3-32:部分回交植株圖2 部分回交后代植株反義蠟質基因PCR檢測

2.2 改良后“93-11”水稻與對照主要農藝性狀和拷種分析

A、B為9311主穗;C、D為2011-60-12植株主穗圖3 “93-11”對照水稻與2011-59植株主穗比較

根據PCR檢測結果,從2個小區各取4棵含有反義蠟質基因陽性植株,考察主要農藝性狀并進行拷種分析.部分編號為2011-59類植株穗長度基本接近“93-11”對照水稻(圖3).從平均值比較顯示,2011-59類型植株每穗實粒數比對照低,但兩者差異統計分析不顯著.比較另外一些農藝性狀和拷種性狀的平均值,除了千粒重,兩種改良后水稻的株高、有效穗和結實率也都與“93-11”對照水稻比較接近,統計分析無顯著差異(表1).

2.3 改良后“93-11”水稻和對照糙米性狀考察

剝去編號分別為2011-59和2011-60的BC4F2和BC3F3種子穎殼.根據糙米是否呈蠟質和非蠟質分離,可以判斷植株反義蠟質基因位點是否為純合狀態.在含有反義蠟質基因的2011-59植株中,糙米都呈蠟質和非蠟質分離,即反義蠟質基因位點是雜合狀態;在含有反義蠟質基因的2011-60植株中,糙米有純合蠟質和雜合兩種類型.

表1 “93-11”水稻及其改良后水稻主要農藝性狀和拷種分析

注:同列表中不同大寫和小寫字母分別表示差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05),標有相同字母表示差異不顯著(P>0.05),下同.

從2011-59小區中取含有反義蠟質基因植株2011-59-1,從編號為2011-60小區中取反義蠟質基因位點純合植株:2011-60-12和“93-11”水稻植株,各隨機取20粒糙米進行比較.結果顯示,2011-60-12植株糙米明顯小于“93-11”對照水稻,2011-59-1植株糙米大小比較接近于“93-11”對照水稻(圖4).

圖4 “93-11”對照(左)、回交4代反義蠟質基因雜合植株(中)和回交3代反義蠟質基因純合植株(左)糙米比較

雖然從植株角度考察,2011-59-1植株的反義蠟質基因位點是雜合狀態,但對于從2011-59-1植株上選出的蠟質糙米,反義蠟質基因位點已經純合.再分別取40粒2011-59-1的蠟質和非蠟質糙米、40粒2011-60-12糙米,以及40?！?3-11”對照水稻糙米,分別測量糙米重量和體積.結果發現,兩種改良后水稻糙米重量和體積都比“93-11”對照水稻極顯著下降,而2011-59-1植株蠟質和非蠟質糙米重量和體積都比2011-60-12糙米極顯著增加.在同一棵2011-59-1植株上收獲的蠟質糙米比非蠟質糙米,重量和體積也都極顯著下降(表2).

2.4 改良后“93-11”水稻和對照糙米部分理化指標分析

分析2011-59-1植株蠟質和非蠟質糙米、2011-60-12蠟質糙米,以及“93-11”對照水稻糙米的直鏈淀粉含量.結果顯示,從編號為2011-59-1植株中選出非蠟質糙米的直鏈淀粉含量比“93-11”對照水稻略有下降,但統計分析差異不顯著.兩種蠟質糙米直鏈淀粉含量都比“93-11”對照水稻極顯著地降低(P<0.01),降低幅度都超過了60%以上.2011-59-1植株非蠟質糙米膠稠度與“93-11”對照水稻也沒有顯著差異,兩種蠟質糙米膠稠度都比“93-11”對照水稻極顯著地增加(P<0.01),而且上升的幅度至少大于92%以上(表3).

表2 “93-11”對照及其改良后水稻40粒糙米重量和體積比較

表3 “93-11”及其改良后水稻植株糙米部分理化指標分析

3 討 論

雜交水稻稻米食味品質優劣與親本稻米食味品質直接相關[18-19].本研究通過雜交及多代回交的方式將反義蠟質基因成功導入“93-11”水稻,不僅降低了稻米的直鏈淀粉含量,而且在更大程度上極顯著地提高了“93-11”水稻稻米的膠稠度.膠稠度直接影響稻米柔軟程度,高膠稠度稻米蒸煮的米飯更柔軟,具有更好的食味品質[20-21].由本研究結果表明,改良后的“93-11”水稻,其稻米柔軟程度會明顯高于原“93-11”對照水稻.將改良后的“93-11”水稻作為父本與原先兩系不育系雜交,由此獲得的雜交組合稻米也將會有更好的食味品質.

隨著分子標記技術的發展,目前已有較多研究者采用分子標記技術輔助改良水稻品質[6,22-23].胡德輝等[24]采用雜交及回交與分子標記輔助結合的方法,對水稻保持系“天B”和“龍特甫B”進行改良,選育出既保持原品種水稻的優良農藝性狀,稻米品質又得到明顯改良的“天B”和“龍特甫B”.侯立恒等[25]將供體水稻控制直鏈淀粉的Wx基因導入到不同恢復系中,得到了直鏈淀粉含量適中、并且主要農藝性狀沒有發生顯著改變的后代.本文以含有反義蠟質基因的“B3”水稻為供體,目前生產上已廣泛應用的“93-11”水稻為受體,同樣利用雜交及回交和反義蠟質基因分子標記輔助篩選,獲得了大多性狀已經與“93-11”受體水稻非常接近的改良型“93-11”水稻.

Tian等[26]針對一般粳型或秈型水稻稻米直鏈淀粉與膠稠度比較分析認為,稻米直鏈淀粉含量與膠稠度之間存在著非常明顯的反相關關系.Li等分析導入了反義蠟質基因的粳型水稻稻米直鏈淀粉含量與膠稠度關系時發現,反義蠟質基因對稻米膠稠度增加的幅度比降低稻米直鏈淀粉含量程度更明顯[11].本研究通過雜交及多代回交將反義蠟質基因導入秈型水稻的研究發現,反義蠟質基因能夠更加明顯增加稻米膠稠度的作用,在秈型水稻中的作用效果與粳型水稻相同.

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