轉錄因子TDF1對擬南芥雄性不育突變體atms1的溫敏調控機制研究

鄭亞潔,高 貝,夏群芳,周樹敏,張 衛

(上海大學 生命科學學院 上海市能源作物育種及應用重點實驗室,上海 200444)

在擬南芥的花藥發育過程中,已知有一些轉錄因子在調控中起到決定性的作用[1]：如bHLH家族的轉錄因子,MYB家族的轉錄因子等[2].其中MYB家族的轉錄因子如：TDF1[3-5](TAPETAL DEVELOPMENTAND FUNCTION1)編碼的是MYB-R2R3家族的轉錄因子.它主要在絨氈層以及小孢子母細胞中表達,突變體中因絨氈層發育異常,導致胼胝質無法降解,使得小孢子聚集在花粉囊中,不能形成正常的花粉粒,最終引起雄性不育表型.

本實驗室在前期的研究中得到了1株在非脅迫溫度范圍內花粉育性受溫度顯著影響的擬南芥溫敏雄性不育突變體atms1[6].在16 ℃時,該突變體育性與野生型相似,花粉全部可育；但隨溫度的升高,育性逐漸下降,到23 ℃時,突變體花粉有一半表現為不育；而到27℃時,突變體花粉則全部不育.經過對突變基因的圖位克隆,發現該突變體在AT1G62940基因上的第四外顯子202 bp處發生點突變,由“G”變為“A”(圖1～2),ATMS1編碼的蛋白第398個氨基酸由野生型的甘氨酸變為天冬氨酸.

圖1 AT1G62940基因上的第四外顯子上發生點突變

本實驗就是通過在擬南芥atms1突變體中過量表達TDF1反義RNA,結合對atms1溫敏雄性不育表型的分析,擬從遺傳分子水平初步探究其中的作用機制.

1 材料與方法

1.1 材 料

Col-0生態型擬南芥(Arabidopsisthaliana)及atms1溫敏雄性不育突變體種子由本實驗室提供.

圖2 ATMS1 CDS序列上的突變位點

菌株DH5ɑ(E.Coli)和GV3101(Agrobacteriumtumefaciens)為本實驗室自制感受態細胞并保存；載體pCAMBIA-1300為本實驗室所有并改造后使用；載體pMD18-T、DNA Marker、各種限制性內切酶、T4連接酶均購自TaKaRa公司.

1.2 方 法

1.2.1 植物cDNA的提取

Col野生型擬南芥23 ℃條件下培養,待其抽薹后,取花序,迅速置于液氮中,Trizol法提取RNA,反轉錄得cDNA,Trizol等試劑及cDNA反轉錄試劑盒均購自TaKaRa公司.

1.2.2 引物設計及TDF1基因片段的克隆

自www.arabidopsis.org網站上下載TDF1的CDS序列,大小為954 bp.根據CDS序列設計引物,上下游引物兩端分別添加SalI和XbaI酶切位點.引物由上海生工生物工程公司進行合成.

引物序列為: 上游F(SalI) 5′-GCGTCGACATGGGAAGACCTCCTTGTT-3′,

下游R(XbaI) 5′-CGTCTAGACTAATAATCGAAATCATTCAAGAG-3′.

采用PCR方法對目的序列進行擴增,擴增采用TaKaRa公司生產的KOD PCR擴增試劑盒.

擴增條件參數為:

由高保真聚合酶擴增得到的PCR產物割膠回收后,加PolyA并純化,與pMD18-T載體連接,得到pMD18-T-TDF1.采用熱激法將重構的T質粒轉化到大腸桿菌DH5ɑ感受態細胞中進行擴增,重組T質粒經酶切鑒定正確后送往上海美吉公司進行測序.

1.2.3 表達載體構建

圖3為本實驗室改造后的pCAMBIA-1300質粒圖譜.首先,將p1300質粒用SalI、XbaI進行酶切并回收質粒片段.然后從pMD18-T載體上切取測序正確的帶有SalI、XbaI酶切位點的TDF1 CDS片段,回收后連入p1300質粒中,并將重組質粒轉化大腸桿菌進行篩選和鑒定.

圖3 p1300 質粒多克隆位點示意圖

1.2.4 農桿菌的轉化與鑒定

采用熱激法將重組質粒p35S:TDF1(-)轉化到根癌農桿菌GV3101中.在含有Rifa,Kana和Gen三重抗性的YEP固體培養基上進行篩選,挑取單菌落進行PCR檢測.將鑒定正確的菌落接種到YEP液體培養基中進行擴增培養,利用浸染法[7-9]轉化擬南芥atms1雜合子植株,收取T0代種子.

1.2.5 陽性苗篩選及鑒定

用50 μg/mL潮霉素B(Hygromycin B)對轉化的T0代種子進行篩選,待抗性板上長出陽性苗后,將其移入土中生長.直至抽薹后,取2～3片葉子,用Edwards一步抽提法提取植株基因組DNA,進行遺傳背景鑒定.

引物序列為: 與突變體匹配上游F(M):5′-AGCCAATGTGTAATGCAAGA-3′,與WT匹配上游F(WT):5′-AGCCAATGTGTAATGCAAGG-3′,通用下游R:5′-TGGACGGCTCTAACCTTC-3′.

擴增條件參數為:

1.2.6 花藥育性觀察

將陽性植株置于23 ℃的培養間生長,待其抽薹后,分兩組分別放到16、27 ℃的人工氣候培養箱中培養,2 d后重新置于23 ℃培養間中生長,取溫度處理時處于花藥發育第八期的花,用亞歷山大染色法處理后,觀察花粉育性.

1.2.7 過量表達植株Real-time PCR檢測

常溫培養擬南芥atms1突變體和p35S:TDF1(-)轉基因植物,抽薹后平均分成兩組,分別移至16和27 ℃處理24 h后,取花序,抽提RNA反轉錄成cDNA,以此為模板進行熒光定量PCR的檢測,選用的儀器是BIORAD IQ5,管家基因UBQ10作為內參,反應體系為20 μL,如下：

SYBR Primix Ex Taq (2×) 10 μL

F primer (10×) 0.4 μL

R primer (10×) 0.4 μL

DNA 模板 2 μL

ddH2O 7.2 μL

TOTAL 20 μL

Real-time PCR 擴增條件參數為：

95 ℃ 30 s

表1 Real-time PCR 所用引物

2 結果與分析

2.1 目的片段過量表達載體構建

根據合成引物的退火溫度,設計溫度梯度測試,得到最佳退火溫度為58 ℃,然后進行PCR擴增,得到970 bp左右的目的條帶(圖4).目的片段連入pMD18-T質粒,經擴增、篩選和鑒定后進行測序,在NCBI網站上對測序結果進行比對分析,顯示匹配率100%；將目的片段連入pCAMBIA-1300質粒,構建成p35S:TDF1(-)過量表達載體,用XbaI、SalI酶對重組質粒進行酶切,得到約970 bp的條帶及剩余載體條帶(圖5),以上結果說明正確的目的基因被成功連入了pCAMBIA-1300質粒,構建成了反義RNA載體.

1:擴增產物條帶;M：分子marker圖4 TDF1 CDS擴增

1、2:p35S:TDF1(-) 過表達質粒載體;M:分子marker圖5 p35S:TDF1(-) 表達載體的酶切鑒定

2.2 轉基因植株的鑒定

轉基因鑒定采用擴增TDF1 CDS全長的引物,陽性苗中會擴增出2個條帶,分別約為1230、970 bp,前者為TDF1的Genomic序列,后者為TDF1的CDS序列,為目的條帶.atms1背景鑒定采用實驗室已有SNP引物(圖2),目的片段大小為523 bp,即：若使用F(M)/R、F(WT)/R引物同時PCR轉基因植株的基因組DNA,只有F(M)/R擴增出目的條帶,則該植株為atms1突變體純合子；若只有F(WT)/R引物能夠擴增出目的條帶,則該植株為野生型；若兩對引物都能擴增出條帶,則該轉基因植株背景為atms1雜合子.對12株陽性苗基因組進行PCR鑒定,顯示其中9株為轉基因植株,分別為1、2、3、4、5、6、8、9、10號(圖6),然后再將這9株植物進行atms1背景的鑒定,結果顯示轉基因植株1、2、3、4、5、8、9、10號為atms1雜合子,6號為野生型(圖7).

1～12:陽性苗;+:陽性對照;M:分子marker圖6 轉基因植物PCR鑒定

1～6、8～10：轉基因陽性苗;F(M)R:突變體基因擴增引物;F(WT)/R:野生型基因擴增引物圖7 轉基因植物atmsl背景鑒定

2.3 花藥育性觀察

將鑒定后1、2、3號陽性苗進行傳代,在T3代植株中篩選獲得既是轉基因純合子又是atms1純合子背景的植株.通過溫度處理后,對花粉育性進行觀察.結果顯示：atms1突變體在16 ℃時花粉粒飽滿呈紅色,育性良好(圖8A)；27℃時花藥中的花粉粒呈綠色,且降解呈碎片狀,表現為完全不育(圖8B)；而轉基因atms1植株的花藥花粉在16、27 ℃時育性都得到恢復(圖8C、D).

A、B：atms1突變體16、27 ℃處理的花藥;C、D：p35S:TDF1(-)轉基因atms1植株16、27 ℃處理的花藥(Bars為20 μm)圖8 不同溫度下轉基因植物的花粉亞歷山大染色

2.4 Real-time PCR

溫度處理后的atms1突變體和轉基因植物經Real-time PCR檢測結果顯示(圖9)：atms1突變體中TDF1的表達量16 ℃處理組遠高于27 ℃處理組；而在p35S:TDF1(-)轉基因atms1中,16、27 ℃組TDF1的表達量與16 ℃atms1相比明顯下降,說明轉基因植株中TDF1的轉錄水平受到明顯下調,但是與atms1突變體27℃的表達量比較,總體水平還是略有增加.另外,ATMS1m表達量在atms1中呈現16 ℃處理組高于27 ℃處理組,約為27 ℃處理組的5倍,而在p35S:TDF1(-)轉基因atms1中ATMS1m的表達量在16 ℃和27 ℃時都較atms1突變體27 ℃時有所增加,這說明ATMS1m的表達量的上升對于突變體atms1育性的恢復有積極的作用.

A:p35S :TDF1 (-) 轉基因植株和 atms1突變體中,TDF1的表達; B：p35S :TDF1 (-) 轉基因植株和 atms1突變體中,ATMS1m的表達圖9 p35S:TDF1(-)轉基因植物和atms1中TDF1、ATMS1m的轉錄表達

3 討 論

ATMS1是目前已知的第一個在非脅迫溫度變化范圍內直接影響擬南芥雄性不育性狀的基因.在atms1突變體中,16 ℃時ATMS1mmRNA的積累量明顯高于27 ℃的積累量,表明轉錄水平上的變化可能導致了該突變體育性隨溫度不同而發生變化,即:27 ℃時花藥完全不育,23 ℃時呈現部分不育,16 ℃時育性與野生型相同.

TDF1是MYB-R2R3家族的轉錄因子.它的突變體中胼胝質無法降解使得小孢子聚集在花粉囊中,表現為完全不育[10].通過在atms1突變體中導入用于降低TDF1轉錄水平的反義RNA表達載體,發現在p35S:TDF1(-)轉基因植株中TDF1的表達量明顯下降,約為atms1突變體16 ℃時的四分之一,表明p35S:TDF1(-)這個反義RNA表達載體在擬南芥體內有效地抑制了TDF1的表達.但這種抑制作用還不足以使轉基因植物表現出tdf1突變體的表型[10]；Real-time PCR的結果顯示p35S:TDF1(-)反義RNA雖然抑制了TDF1的表達,但與atms1突變體在27 ℃的情況比較,TDF1的表達量還是有所提高的,反應到ATMS1m的表達水平上就更加明顯,p35S:TDF1(-)轉基因atms1中不論16 ℃還是27 ℃,ATMS1m的表達水平都高于atms1突變體在27 ℃的水平.這提示在擬南芥體內ATMS1m的表達量可能存在一個閾值,低于此閾值時,植株表現為完全不育,高于此閾值時,對植株育性的影響較小.而TDF1又正調控于ATMS1m的表達；當TDF1表達受抑制時,ATMS1m的表達量也會減少,但只有當ATMS1m表達量低于一定閾值時,花粉的育性才會受到顯著影響.而這個閾值可能就是ATMS1m在27 ℃的表達水平.因此,本研究認為TDF1對ATMS1m具有一定的正向調控作用,通過ATMS1m表達水平的變化最終影響花粉育性的變化,而對于其中更深入的調控機制則有待于進一步的研究.

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