大腸埃希菌生物膜在三種導尿材料上形成的對比方

芳畢等

【摘要】 目的：觀察不同材質導尿管對大腸埃希菌生物膜形成的影響。方法：在乳膠、純硅膠、硅橡膠材質導尿管膜片上制備大腸埃希菌生物膜，掃描電鏡觀察生物膜的形態。用沖洗、沖洗+超聲振蕩方法處理附有不同生長時期生物膜的導尿管，通過菌落計數法了解兩種方法對不同時期生物膜的清除效應。結果：乳膠、純硅膠、硅橡膠導尿管生物膜內均有細菌團塊樣聚集，可見纖維素樣物質交聯。硅橡膠導尿管生物膜內纖維素樣交聯物相對較少。在生物膜形成的初期，兩種處理方法具有相同清除效應；但當生物膜趨于成熟后，單用沖洗方法難以將黏附細菌洗脫。結論：建議選擇使用經濟、實用的硅橡膠導尿管。在生物膜形成初期，對導尿管一般沖洗能較徹底地清除黏附細菌。

【關鍵詞】 導尿管； 大腸埃希菌； 生物膜； 掃描電鏡

留置導尿是臨床常用的一種操作技術，導尿管伴隨尿道感染（Catheter-associated urinary tract infection，CAUTI）是留置導尿引起的一種常見的醫院感染。盡管采取無菌操作等措施，仍然有1/3導尿管伴隨尿路感染無法控制。導尿管的生物材料等因素與泌尿系統感染有直接關系。筆者對比不同材質導尿管生物膜形成的過程，為臨床合理選擇導尿管提供客觀依據。

1 材料與方法

1.1 導尿管種類 純硅膠導尿管（廣州市香雪生物醫學工程有限公司）、乳膠導尿管（廣州市韋士泰醫療器械有限公司）、硅橡膠導尿管（秦皇島市旭明醫用硅橡膠制品有限公司）。

1.2 標準菌株 大腸埃希菌菌株：沈陽醫學院病原生物學教研室提供（經ATB生化鑒定）。

1.3 生物膜的制備 將三種材料的導尿管用打孔器制備成直徑為0.7 cm圓片，高壓蒸汽滅菌后分別放入含有2 mL/孔MH肉湯的12孔培養板，每孔加入0.5比濁的大腸埃希菌菌液50 ?L，置于37 ℃生化培養箱中培養，每24小時更換培養液一次，共培養3 d。

1.4 掃描電鏡觀察 取出培養18、24、48、72 h導尿管膜片，用無菌生理鹽水沖洗，洗掉浮游細菌，至2.5%戊二醛溶液中4 ℃固定2 h，以pH 7.2的磷酸緩沖液沖洗3次，20 min/次，再以1%鋨酸4 ℃固定2 h，4 ℃磷酸緩沖液沖洗3次，20 min/次，梯度乙醇脫水，醋酸異戊酯置換，CO2臨界點干燥，離子噴金鍍膜，通過SEM進行觀察。

1.5 處理生物膜 分別在孵育18、24、48、72 h各取出6塊膜片，分成兩組，每組3片，分別用以下兩種方法處理：（1）用0.9%NS 2mL沖洗5次，收集洗脫液于20 mL無菌離心管里。（2）用0.9%NS 2 mL沖洗4次，置于含2 mL 0.9%NS的無菌試管中，超聲震蕩120 W，15 min，收集所有洗脫液（6 mL）于20 mL無菌離心管里。將以上兩種方法所得洗脫液吸取0.1 mL，倍比稀釋至10萬倍，取出0.1 mL稀釋液注入無菌平皿中，加入高壓蒸汽滅菌后冷卻至40 ℃左右的營養瓊脂中混勻，置于37 ℃生化培養箱，孵育24 h，用全自動菌落分析儀（杭州迅數科技有限公司，型號HR2）計數細菌培養基上菌落數量。上述實驗重復進行三次。

1.6 菌落計數的換算 按以下公式算出實際菌落數。實際菌落數（CFU/cm3）=肉眼可計菌落數×稀釋倍數/膜片體積，取實際菌落數的常用對數（lgCFU/cm3）為標準菌落計數單位。

1.7 統計學處理 菌落計數換算為標準菌落計數單位，采用SAS 8.1軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗或方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 掃描電鏡觀察 大腸埃希菌在純硅膠、乳膠、硅橡膠三種材質表面孵育早期（18～24 h），無明顯細菌生物膜形成。培養48 h后，細菌生物膜形成。硅橡膠導尿管表面細菌生物膜形成較晚且生物膜內細菌數量相對較少，見圖1。

2.2 菌落計數比較 大腸埃希菌在純硅膠、乳膠、硅橡膠三種材質表面孵育早期（18～24 h），沖洗和沖洗+振蕩兩種處理方法的生物膜內細菌的菌落計數比較差異無統計學意義（P>0.05），且經過沖洗+振蕩處理后三種材質間的對數菌落計算的比較差異也均無統計學意義（F=0.03，P=0.9584；F=3.56，P=0.0923）。而在生物膜形成的后期48 h和72 h時，沖洗和沖洗+振蕩兩種處理方法的生物膜內細菌的菌落計數比較差異均有統計學意義（P<0.05），三種材質間的對數菌落計算的比較差異均有統計學意義（F=16.77，P=0.0015；F=89.21，P=0.0001），見表1。

3 討論

細菌生物膜（bacteria biofilm，BBF）是附著于惰性或者活性實體表面的細菌細胞和包裹著細菌的細菌自身所分泌的含水聚合性基質組成的結構性細菌群落。細菌生物膜內的細菌具有傳染性和致病性，是醫院感染最主要的原因[1-2]。研究認為超過60%的感染是由細菌生物膜引起的[3]。細菌能黏附幾乎所有醫療器械的材料表面形成生物膜，其中以中心靜脈導管、導尿管更為常見[4-5]。細菌生物膜是導尿管伴隨尿路感染的重要物質基礎。

導尿管伴隨尿路感染可由多種微生物引起，在眾多病原體中，大腸埃希菌的檢出率為最高[6]。筆者以臨床較常使用的三種材質的導尿管為載體，在大腸埃希菌細菌懸液中體外分別孵育18、24、48、72 h，制備細菌生物膜模型，用掃描電鏡觀察生物膜的形成過程。當細菌未黏附至生物材料前，生物材質本身的化學成分影響細菌的生長繁殖，關系到最終黏附于生物材料上的細菌數量。生物膜內細菌寄生于體內植入物表面形成膜狀物，包裹在導尿管表面，生物膜內細菌通過特殊的耐藥機制和緩慢釋放引起患者泌尿道和全身感染[7]。如表1所示，不同材質導尿管細菌生物膜情況不同。通過掃描電鏡觀察生物膜形成的動態過程可見，生物膜形成分為兩個階段：首先由細菌表面疏水性蛋白或多糖黏附素對生物材料的初始附著，形成細菌群落；而后細菌主要通過多糖胞間黏附素介導，相互聚集，形成生物膜[8-10]。細菌在孵育第18～24小時增殖較慢，由于細菌被接種到培養基后最初的一段時間，細菌需要適應新環境，為持續不斷地增殖做準備。第48～72小時細菌分裂繁殖速度明顯增快。三種材料的生物膜內均見細菌團塊聚集，菌體周圍可見由纖維素樣物質交聯的現象。但觀察可見，硅橡膠導尿管材料中，有的部位僅見大量細菌附著，纖維素樣物質交聯相對較少。纖維素樣交聯物是細菌分泌的多糖基質、纖維蛋白、脂蛋白。細菌大量聚集，其間由纖維素樣物質交聯，可使抗生素的作用大大地減弱。掃描電鏡下圖像說明，硅橡膠材料組織相容性較好，對比純硅膠和乳膠導尿管，形成生物膜能力相對較差。

鑒于生物膜內細菌生長的動態規律，通過不同方法對黏附大腸埃希菌的三種材質導尿管進行處理，比較兩種方法的優劣。如表1～2所示，在生物膜形成的初期（24 h），沖洗和沖洗+超聲振蕩兩種方法處理生物膜，均能較徹底地洗脫黏附細菌，這可能與早期生長細菌菌量較少及黏附不牢固有關；隨著生物膜的成熟，細菌繁殖增多，且黏附牢固，這時單用沖洗方法難于將生物膜洗脫下來，被洗脫下來的菌落數與經超聲振蕩所得菌落數相比，已明顯減少；從沖洗組的動態看，菌落數隨著培養時間的延長有逐漸減少的趨勢，與超聲振蕩的趨勢相反。

對臨床需要長期留置導尿管患者，除臨床常規采取的無菌護理外，使用不同材料導尿管可有效較少導尿管相關尿路感染的發生[11]。建議選擇使用經濟、實用的硅橡膠導尿管，在留置導尿管早期進行膀胱沖洗，可減少導尿管伴隨尿路感染的發生。

參考文獻

[1]沈建，馮晨，沈香娣，等.銅綠假單胞菌體外生物膜模型的建立和鑒定[J].醫學研究雜志，2013，42（1）：50-54.

[2] Mateo M，Maestre J R，Aguilar L，et al.Strong slime production is a marker of clinical significance in Staphylococcus epidermidis isolated from intravascular catheters[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2008，27（4）：311-314.

[3] Jacobsen S M，Stickler D J，Mobley H L T，et al.Complicated catheter-associated urinary tract infections due to Escherichia coli and Proteus mirabilis[J].Clin Microbiol Rev，2008，21（1）：26-59.

[4]邱凱.細菌生物膜預防與去除的研究進展[J].中國消毒學雜志，2011，28（3）：358-360.

[5] Leone M，Albanèse J，Garnier F，et al.Risk factors of nosocomial catheter-associated urinary tract infection in a polyvalent intensive care unit[J].Intensive Care Med，2003，29（7）：1077-1080.

[6]方芳，畢海波，陳冬梅，等.留置導尿致尿路感染病原菌分布及耐藥性分析[J].沈陽醫學院學報，2010，12（4）：199-200.

[7]許宏，韋莉萍.留置導尿相關感染的研究進展[J].護士進修雜志，2005，20（1）：7-8.

[8]葉聯華，黃云超，李高峰，等.生物材料植入后發生感染與表皮葡萄球菌生物膜[J].生物醫學工程與臨床，2010，14（1）：79-82.

[9]陳曦偉，崔玉東，張華，等.金黃色葡萄球菌生物膜形成的研究進展[J].黑龍江畜牧獸醫，2011（6）：34-36.

[10] Qin Z，Zhang J，Hu Y，et al.Organic compounds inhibiting S.epidermidis adhe sion and biofilm formation[J].Ultramicroscopy，2009，109（8）：881-888.

[11]袁望舒，劉忠良，張海娜，等.導尿管相關尿路感染的防治現狀及展望[J].中華醫院感染學雜志，2011，21（9）：1936-1938.

（收稿日期：2013-12-20） （本文編輯：歐麗）

鑒于生物膜內細菌生長的動態規律，通過不同方法對黏附大腸埃希菌的三種材質導尿管進行處理，比較兩種方法的優劣。如表1～2所示，在生物膜形成的初期（24 h），沖洗和沖洗+超聲振蕩兩種方法處理生物膜，均能較徹底地洗脫黏附細菌，這可能與早期生長細菌菌量較少及黏附不牢固有關；隨著生物膜的成熟，細菌繁殖增多，且黏附牢固，這時單用沖洗方法難于將生物膜洗脫下來，被洗脫下來的菌落數與經超聲振蕩所得菌落數相比，已明顯減少；從沖洗組的動態看，菌落數隨著培養時間的延長有逐漸減少的趨勢，與超聲振蕩的趨勢相反。

對臨床需要長期留置導尿管患者，除臨床常規采取的無菌護理外，使用不同材料導尿管可有效較少導尿管相關尿路感染的發生[11]。建議選擇使用經濟、實用的硅橡膠導尿管，在留置導尿管早期進行膀胱沖洗，可減少導尿管伴隨尿路感染的發生。

參考文獻

[1]沈建，馮晨，沈香娣，等.銅綠假單胞菌體外生物膜模型的建立和鑒定[J].醫學研究雜志，2013，42（1）：50-54.

[2] Mateo M，Maestre J R，Aguilar L，et al.Strong slime production is a marker of clinical significance in Staphylococcus epidermidis isolated from intravascular catheters[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2008，27（4）：311-314.

[3] Jacobsen S M，Stickler D J，Mobley H L T，et al.Complicated catheter-associated urinary tract infections due to Escherichia coli and Proteus mirabilis[J].Clin Microbiol Rev，2008，21（1）：26-59.

[4]邱凱.細菌生物膜預防與去除的研究進展[J].中國消毒學雜志，2011，28（3）：358-360.

[5] Leone M，Albanèse J，Garnier F，et al.Risk factors of nosocomial catheter-associated urinary tract infection in a polyvalent intensive care unit[J].Intensive Care Med，2003，29（7）：1077-1080.

[6]方芳，畢海波，陳冬梅，等.留置導尿致尿路感染病原菌分布及耐藥性分析[J].沈陽醫學院學報，2010，12（4）：199-200.

[7]許宏，韋莉萍.留置導尿相關感染的研究進展[J].護士進修雜志，2005，20（1）：7-8.

[8]葉聯華，黃云超，李高峰，等.生物材料植入后發生感染與表皮葡萄球菌生物膜[J].生物醫學工程與臨床，2010，14（1）：79-82.

[9]陳曦偉，崔玉東，張華，等.金黃色葡萄球菌生物膜形成的研究進展[J].黑龍江畜牧獸醫，2011（6）：34-36.

[10] Qin Z，Zhang J，Hu Y，et al.Organic compounds inhibiting S.epidermidis adhe sion and biofilm formation[J].Ultramicroscopy，2009，109（8）：881-888.

[11]袁望舒，劉忠良，張海娜，等.導尿管相關尿路感染的防治現狀及展望[J].中華醫院感染學雜志，2011，21（9）：1936-1938.

（收稿日期：2013-12-20） （本文編輯：歐麗）

鑒于生物膜內細菌生長的動態規律，通過不同方法對黏附大腸埃希菌的三種材質導尿管進行處理，比較兩種方法的優劣。如表1～2所示，在生物膜形成的初期（24 h），沖洗和沖洗+超聲振蕩兩種方法處理生物膜，均能較徹底地洗脫黏附細菌，這可能與早期生長細菌菌量較少及黏附不牢固有關；隨著生物膜的成熟，細菌繁殖增多，且黏附牢固，這時單用沖洗方法難于將生物膜洗脫下來，被洗脫下來的菌落數與經超聲振蕩所得菌落數相比，已明顯減少；從沖洗組的動態看，菌落數隨著培養時間的延長有逐漸減少的趨勢，與超聲振蕩的趨勢相反。

對臨床需要長期留置導尿管患者，除臨床常規采取的無菌護理外，使用不同材料導尿管可有效較少導尿管相關尿路感染的發生[11]。建議選擇使用經濟、實用的硅橡膠導尿管，在留置導尿管早期進行膀胱沖洗，可減少導尿管伴隨尿路感染的發生。

參考文獻

[1]沈建，馮晨，沈香娣，等.銅綠假單胞菌體外生物膜模型的建立和鑒定[J].醫學研究雜志，2013，42（1）：50-54.

[2] Mateo M，Maestre J R，Aguilar L，et al.Strong slime production is a marker of clinical significance in Staphylococcus epidermidis isolated from intravascular catheters[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2008，27（4）：311-314.

[3] Jacobsen S M，Stickler D J，Mobley H L T，et al.Complicated catheter-associated urinary tract infections due to Escherichia coli and Proteus mirabilis[J].Clin Microbiol Rev，2008，21（1）：26-59.

[4]邱凱.細菌生物膜預防與去除的研究進展[J].中國消毒學雜志，2011，28（3）：358-360.

[5] Leone M，Albanèse J，Garnier F，et al.Risk factors of nosocomial catheter-associated urinary tract infection in a polyvalent intensive care unit[J].Intensive Care Med，2003，29（7）：1077-1080.

[6]方芳，畢海波，陳冬梅，等.留置導尿致尿路感染病原菌分布及耐藥性分析[J].沈陽醫學院學報，2010，12（4）：199-200.

[7]許宏，韋莉萍.留置導尿相關感染的研究進展[J].護士進修雜志，2005，20（1）：7-8.

[8]葉聯華，黃云超，李高峰，等.生物材料植入后發生感染與表皮葡萄球菌生物膜[J].生物醫學工程與臨床，2010，14（1）：79-82.

[9]陳曦偉，崔玉東，張華，等.金黃色葡萄球菌生物膜形成的研究進展[J].黑龍江畜牧獸醫，2011（6）：34-36.

[10] Qin Z，Zhang J，Hu Y，et al.Organic compounds inhibiting S.epidermidis adhe sion and biofilm formation[J].Ultramicroscopy，2009，109（8）：881-888.

[11]袁望舒，劉忠良，張海娜，等.導尿管相關尿路感染的防治現狀及展望[J].中華醫院感染學雜志，2011，21（9）：1936-1938.

（收稿日期：2013-12-20） （本文編輯：歐麗）