肺缺血再灌注損傷動物模型的研究進展

張皓　齊海

【摘要】 缺血再灌注損傷（IRI）是器官移植研究的重點。肺缺血再灌注損傷（LIRI）的發生與白細胞活化分泌促炎因子、活性氧增多、細胞內鈣離子濃度升高等有關，因此研究LIRI主要側重這幾個方面。現在各種動物模型（如鼠、兔、犬等）的建立能夠很好地模擬這些發生，解決了臨床直接研究的難題。文章就這些方面的研究進展作一綜述。

【關鍵詞】 肺； 缺血再灌注損傷； 動物； 模型

肺缺血再灌注損傷（LIRI）是指肺移植、體外循環手術、肺缺血再灌注后，肺缺血引起的肺損傷沒有減輕，反而加重的病理現象[1]。近年來，肺缺血再灌注損傷已經成為影響早期肺移植后失功的主要原因，是目前研究的重要方向。用動物模型來研究肺缺血再灌注損傷，提供了研究平臺，而且可以為臨床上肺缺血再灌注損傷的防治提供理論基礎。因此，建立其動物模型的作用不言而喻。本文就肺缺血再灌注損傷動物模型的研究進展作一綜述。

1 簡介

目前研究LIRI的動物模型包括：肺缺血-再灌注損傷模型、肺移植模型、肺動脈栓塞模型等，實施方法：阻斷單側肺門，實驗肺無血液循環及氣體交換[2-3]；介入堵塞肺動脈產生急、慢性動脈栓塞[4-5]；離體肺通過灌注、保存方法后移植，肺完全缺血而有氣體交換[6]。可分別阻斷肺動、靜脈，阻斷單側肺門血管后恢復雙肺通氣，用來產生外科手術中阻斷肺血管導致LIRI的效果[2]。目前有多種實驗動物被選作用來建立肺缺血再灌注模型，如大鼠、犬、兔以及豬等[7]。

2 發生機制

LIRI可導致肺移植后發生原發性移植肺功能障礙，表現為肺動脈壓升高、肺出血、肺水腫和急性呼吸功能衰竭，發生機制與活性氧產生增多、細胞內鈣超載、中性粒細胞活化和高能磷酸化合物生成障礙等因素有關[8-9]。目前以活性氧產生增多、中性粒細胞活化和鈣超載的研究最為多見。

2.1 活性氧增多 肺再灌注后，肺血液循環和氣體交換恢復，肺內氧含量增加，氧自由基大量釋放損傷肺泡上皮細胞及血管內皮細胞，損害了血管通透性，組織內水分聚積，導致細胞代謝障礙，引起肺的損傷[10]。LIRI時活性氧增加，氧自由基爆發是肺損傷的根本原因[11]。機體清除氧自由基主要靠超氧化物歧化酶，其活性決定清除氧自由基的能力，其能催化超氧自由基歧化為過氧化氫，繼而降解為氧氣和水[11-12]。氧自由基（OFR）導致肺損傷的原理是：（1）直接損傷DNA；（2）脂質過氧化：導致細胞及細胞器膜損傷；（3）氧化氨基：酶失活及多肽鏈斷裂；（4）影響基因的轉錄，誘導炎癥相關基因的表達，產生多種致炎因子，導致炎細胞的激活[13]。Shimoyama等[14]將離體鼠肺灌洗液中加入抑肽酶，丙二醛減少，氧濃度增加。IRI使丙二醛增多、氧化物歧化酶的活性減小[15]。李潁川等[16]發現再灌注后肺內氧自由基產生增加使超氧化物歧化酶含量明顯下降，破壞肺內皮細胞功能和結構，導致肺損傷。丙二醛反映機體內脂質過氧化的程度，可作為再灌注肺損傷間接評估指標[17]。

2.2 中性粒細胞活化 中性粒細胞（PMN）在肺IRI中有重要的作用，由其分泌的促炎因子導致[13]。IRI導致肺損傷時，促炎與抗炎因子的比例失調，炎癥因子增加，抗炎因子減少，導致炎癥。炎癥因子進一步激活多種炎癥細胞因子，導致“瀑布樣”級聯效應，出現肺損傷[13]。促炎因子在PMN內部及其他細胞間進行調節，從而導致炎癥反應[18]。

2.3 細胞內鈣超載 鈣超載導致細胞膜、細胞器功能障礙，細胞膜通透性增加，線粒體功能障礙，產生ATP減少；鈣離子依賴性蛋白酶活性增加，生成自由基增多，造成肺損傷[19]。主要原因：缺血后，細胞內鈉-鉀-ATP酶功能障礙，因此細胞水腫；恢復血供，鈉離子被轉移到細胞外，引起鈣離子被交換入細胞內[19]。鈣超載是指：缺血再灌注致細胞內鈣離子增加引起細胞的結構和功能損害[20]。

3 模型建立

3.1 小鼠肺缺血再灌注損傷模型 準備：禁食12 h，禁水4 h。

阿托品0.01 mg/kg肌注，2%戊巴比妥鈉注射液60 mg/kg腹腔麻醉，必要時6 mg/kg追加麻藥[21]。取仰臥位，固定于顯微手術臺上，頸胸部手術區備皮。采用20 G靜脈留置針作氣管插管。連接呼吸機，見到胸廓起伏，則插管成功，固定。呼吸機頻設率為130～150次/min，潮氣量150～200 mL/min，吸呼比1：1.5。實驗組：（IR組）：腹腔注射肝素500 U/kg。10 min后，備皮區常規消毒，顯微鏡下取橫切口約8 mm，鈍性分離胸大小肌，從第3肋間進胸，暴露肺門，微血管夾斷左側肺門，左肺無通氣。阻斷60 min后恢復左肺通氣及循環，逐層關胸。術后置于32 ℃溫箱中，待小鼠清醒后，拔氣管插管。對照組（sham組）：僅暴露左肺門，觀察60 min后關胸，其余操作同IR組。

3.2 大鼠肺缺血再灌注損傷模型 鼠禁食12 h，禁水4 h，3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射，氣管切開，插管，機械通氣，呼吸頻率70次/min，吸呼比1：1.5，取左側胸部第5肋間前外側切口，解剖肺門，靜脈注射肝素鈉（100 U/kg）[10]。阻斷肺門30 min，再灌注120 min[22]。阻斷后肺萎縮，變為暗紫色，開放后肺迅速膨脹，顏色恢復淡紅色[23]。

3.3 兔肺缺血再灌注損傷模型 肌注阿托品0.5 mg，靜脈2%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，麻醉維持：2%戊巴比妥鈉，每次5 mg/kg，維持麻醉深度[24]。氣管插管接呼吸機。呼吸機參數設定：頻率30次/min，吸呼比1∶1，氧濃度100%，潮氣量10 mL/kg，游離左肺門。游離右側股動脈，置入生理儀監測導管，檢測動脈壓（MAP）、心率（HR）。取右側臥位，取左側3、4肋間切口，進胸，解剖左肺門。分別游離左側肺動脈、左肺上、下靜脈，靜脈注入肝素（1.0 mg/kg）

10 min后，可分別阻斷肺動脈及上、下肺靜脈1 h后再順序開放肺上、下靜脈和肺動脈或單純阻斷肺動脈1 h，手術中左肺持續通氣[25]。

3.4 犬肺原位常溫缺血再灌注動物模型 禁食水12 h，肌注阿托品，眠乃寧0.05 mL/kg誘導麻醉，用力蒙欣維持麻醉，氣管插管，機械通氣：潮氣量15～20 mL/kg，頻率20次/min，氧濃度60%，持續心電監測。左側股動脈穿刺監測血壓，游離穿刺右側頸外靜脈，監測中心靜脈壓（CVP），監測血氧飽和度。取雙側第4或第5肋間橫切口，切開心包并懸吊，解剖肺動脈主干及左右各支、左右肺靜脈上中下各支。主肺動脈近端置入測壓管，左肺動脈遠端置入灌注管。肝素化（1 mg/kg），阻斷左肺動脈、阻斷左主支氣管、阻斷左肺靜脈各支，左肺動脈灌注常溫LPD液，左肺常溫阻斷120 min，開放左肺循環及支氣管。再灌注120 min后，留取病理標本，再灌注240 min后，留取病理標本。

4 結語

自從McCord[26]提出了缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion-injury，IRI）的概念以來，至今對各器官組織的缺血再灌注損傷的研究一直成為醫學領域的重點和難點。對于肺缺血再灌注而言，因為肺保護技術的發展，近二十年間肺IRI的發生明顯減輕，但缺血再灌注導致的肺損傷仍是致患者早期死亡及發生晚期并發癥的主要原因，且嚴重的肺IRI還與移植后發生免疫排斥反應、阻塞性細支氣管炎等有關[27-29]。因此，肺缺血再灌注損傷動物模型的建立對于肺移植理論及實踐研究意義非凡，為臨床上肺缺血再灌注損傷提供新的治療思路[30]。

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（收稿日期：2013-10-14） （本文編輯：歐麗）