果汁中柑橘屬成分實時熒光PCR檢測方法

梁宇斌，牟靖芳，李曉明，梁德沛

（廣東產品質量監督檢驗研究院，國家食品質量監督檢驗中心（廣東），廣東順德528300）

果汁中柑橘屬成分實時熒光PCR檢測方法

梁宇斌，牟靖芳，李曉明，梁德沛*

（廣東產品質量監督檢驗研究院，國家食品質量監督檢驗中心（廣東），廣東順德528300）

通過分析20條不同柑橘屬植物的trn L基因序列，設計柑桔屬植物特異性擴增引物。通過對蘋果、梨、葡萄等多種水果成分的特異性篩選，建立檢測柑桔屬植物成分的SYB Green實時熒光PCR檢測方法，該方法對柑桔DNA的檢測低限為0.1 pg/μL。用該方法檢測10種橙汁及其飲料商品，結果表明，該方法能夠檢測到橙汁中的柑桔屬植物成分。該方法可用于果汁或食品中柑桔屬植物成分的鑒別。

果汁；柑橘屬植物成分；trn L基因；實時熒光PCR；SYB Green

近年來，隨著人民生活水平的不斷提高，消費者對具有較高營養價值的果汁及果汁飲料的消費量也越來越大[1]。巨大的市場需求導致摻偽行為涉入果汁行業，嚴重損害消費者的利益。果汁鑒偽檢測技術的研究具有非常重要的實際意義。目前，人們鑒別摻偽果汁的方法多基于各種水果特有的標志性化合物[2-5]。但是，果汁摻假手段越來越高明，從最初的簡單勾兌水發展到現在的根據原果汁的特征圖譜進行調配，導致開展鑒偽工作的難度也越來越高[6]。

分子生物技術以其簡便、準確、快速、靈敏度高等特點，可從基因水平分析食品原料及其產品的特性與來源，在食品生物成分的鑒別方面展現廣闊的應用前景[7]。近年來，國內外科研工作者開始利用分子生物學技術開發果汁鑒偽檢測技術。Ng與Chang等[8]利用PCR技術檢測鮮榨橙汁與再生橙汁之間的區別。劉偉紅等[9]利用PCR技術根據橙UDP-葡糖基轉移酶蛋白基因設計特異性擴增引物，研究出一種可用于果汁中的柑橘屬成分的檢測及鑒偽方法。韓建勛等[10]利用實時熒光PCR技術開發出一種檢測果汁中梨成分的方法。Palmieri L.等[11]根據5S rRNA基因序列和ANS（anthocyanidin synthase）序列設計特異性引物，用實時熒光PCR方法檢測食品中的桔子、菠蘿、藍莓、草莓成分。但未見利用實時熒光PCR技術開展對果汁中柑橘屬植物成分進行檢測及鑒偽的研究。

本研究通過分析多種柑橘屬植物trn L基因，設計柑橘屬植物特異性引物，擬建立一種可檢測果汁中柑橘屬植物成分的SYB Green實時熒光PCR檢測方法，以其為果汁分子生物學鑒偽體系的建立奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品材料

14種果實樣品，包括柑桔、臍橙、蜜桔、貢柑、葡萄柚、柚子、檸檬、梨、蘋果、山楂、香蕉、草莓、葡萄、獼猴桃，購自超市；橙汁及橙汁飲料10種，其中100%橙汁4種（A、B、C、D），橙汁飲料6種（E、F、G、H、I、J），所有樣品均購自超市。

1.1.2 PCR擴增引物

從NCBI數據庫選取20條不同柑橘屬植物的trn L基因序列（詳細見表1），通過Clustal X軟件對序列進行比對分析，找到同源性序列區間，再利用Beacon Designer7.9軟件設計出一對特異性擴增柑橘屬植物成分的引物：citrus-trnl-F：5′-GAAAGCGAAAAA GGGGGATA-3′，citrus-trnl-R：5′-GGGCAGTCAACTCCATTTGT-3′，擴增片段長度為69 bp，Tm值為79.7℃。以上引物序列由上海生工有限公司合成。

1.1.3 主要試劑

果汁DNA提取液：CTAB緩沖液[2%CTAB，100mmol/LTris-HCl，20mmol/LEDTA，1.4mmol/LNaCl，pH 8.0]；蛋白酶K溶液（20mg/mL）；1×TE緩沖液；其它試劑或溶劑均為分析純級或生化純級。

植物基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；實時熒光PCR反應采用的2×SYBR Premix Ex TaqTM購于大連寶生物工程有限公司。

1.1.4 主要儀器與設備

微量移液器：德國Eppendorf；三孔電熱恒溫水槽：上海一恒科學儀器有限公司；小型離心機：德國Eppendorf；高速冷凍離心機：德國Sigma；Nanodrop2000微量紫外分光光度計：美國Thermo；LightCycler 1.5熒光定量PCR擴增儀：瑞士Roche。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

1.2.1.1 果汁DNA提取

取10mL果汁，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，4℃下12 000 r/min離心10min，去上清，留沉淀，重復上述步驟3次，將沉淀放于新離心管中，加入5mLCTAB緩沖液與40μL蛋白酶K溶液，振蕩混勻，將離心管放于60℃水浴中溫浴30min，期間不斷搖勻。隨后取1mL懸濁液到新離心管中，冷卻至室溫后，13000 r/min室溫離心10min；將上清轉移至新離心管中，加入等體積的氯仿，劇烈震蕩后，13 000 r/min離心15min，取水相至新的離心管中；加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置30min后，13000 r/min離心15min，去上清，留沉淀；加入600μL 70%乙醇進行上下顛倒后，12 000 r/min離心5min，去上清，將離心管倒置，室溫放置10min～ 20min；加入100μL 1×TE緩沖液溶解沉淀；-20℃保存。

1.2.1.2 果實DNA提取

將不同的水果用解剖刀切碎后，取部分樣品于-20℃條件下進行冷凍，隨后樣品放置于冷凍干燥儀中進行干燥。將干燥后的樣品至于預冷的研缽中磨碎，隨后按照天根生化科技有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒的步驟對樣品進行DNA提取。

1.2.2 DNA提取質量的測定

取樣品DNA溶液2μL，用Nano Drop 2000型微量紫外分光光度計測定樣品DNA在波長為260 nm和280 nm處的紫外吸收值，通過OD260/OD280比值和濃度值判斷DNA的純度和濃度。

同時，根據中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準SN/T 1204-2003《植物及其加工產品中轉基因成分實時熒光PCR定性檢驗方法》[12]，通過檢測DNA樣品中植物內參照基因tRNA Leu基因，確定所提取DNA樣品的可擴增性。其中空白對照以無菌超純水代替DNA樣品，陰性對照為牛肉DNA樣品，陽性對照為經本實驗室驗證DNA質量的大豆DNA樣品。每個樣品各做2個平行管。

1.2.3 實時熒光PCR反應體系

DNA模板2μL（≤100 ng）；2×SYBR Premix Ex TaqTM試劑10μL；引物citrus-trnl-F和citrus-trnl-R各0.4μL（10μmol/L）；用無菌水補至總體積為20μL。擴增反應程序為95℃預變性30 sec；95℃變性10 sec，55℃退火30 sec，40個循環，反應于Roche LightCycler1.5熒光定量PCR擴增儀上進行，閾值設置采用默認值，同時保證閾值不小于陰性對照的最高熒光值，使陰性對照的Ct值大于40。隨后做溶解曲線分析，分析PCR產物的Tm值。每個樣品各做2個平行管。

1.2.4 引物通用性與特異性驗證

以柑桔、臍橙、柚子、檸檬、葡萄柚、貢柑和蜜桔7種柑橘屬植物作為驗證樣品，無菌超純水作為空白對照，驗證citrus-trnl-F/R引物對擴增柑橘屬植物的通用性；以梨、蘋果、山楂、香蕉、草莓、葡萄和獼猴桃7種常見用于生產果汁的果實作為參照樣品，柑桔作為陽性對照，無菌超純水作為空白對照，以確定該引物的特異性。

1.2.5 果汁中柑橘屬植物成分實時熒光PCR靈敏度試驗

以濃度為100 ng/μL的柑桔DNA溶液作為驗證樣品，進行10倍梯度稀釋，驗證特異性引物對citrustrnl-F/R的檢測靈敏度。在實時熒光PCR反應中加入該模板2μL，使其終濃度分別為10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、0.1 pg/μL、0.01 pg/μL。通過分析結果確定引物對柑桔DNA的最低檢出限。以無菌超純水作為空白對照。

表1 引物設計所參考的不同trn L基因片段信息Table1 Information of different trnL gene fragments used for the primer design

1.2.6 商品化柑橘類果汁飲料的檢測

按照上述方法對10種橙汁及橙汁飲料進行DNA提取并進行實時熒光PCR擴增，分析引物的可用性。以無菌超純水作為空白對照，以牛肉DNA為陰性對照；以柑桔DNA為陽性對照。

2 結果與分析

2.1 DNA提取質量

對柑桔、臍橙、柚子、檸檬、葡萄柚、貢柑、蜜桔、梨、蘋果、山楂、香蕉、草莓、葡萄和獼猴桃14種果實提取的DNA樣品進行微量紫外分光光度計檢測，其OD260/OD280均在1.7～2.0范圍之間。（詳細數據未顯示）。同時，根據SN/T 1204-2003利用植物通用引物（tRNA Leu基因）及探針對所有DNA樣品進行擴增，擴增結果見圖1。

擴增結果顯示，陽性對照、陰性對照和空白對照均正常，所有樣品均擴增出典型的S型熒光信號曲線，結果表明所有樣品中均含有適合PCR擴增的DNA。

2.2 引物通用性

為確定所設計的引物citrus-trnl F/R的通用性，用引物citrus-trnl F/R對柑桔、臍橙、柚子、檸檬、葡萄柚、貢柑和蜜桔7種柑橘屬植物進行實時熒光PCR擴增。結果見圖2。

從圖2可見，引物citrus-trnl F/R均可對7種柑橘屬植物的基因組擴增出熒光信號，擴增曲線的Ct值分別為14.90±0.09、12.93±0.17、13.05±0.02、16.28±0.03、15.62±0.04、16.76±0.07和14.60±0.01；溶解曲線分析結果顯示各擴增產物均在溫度（79.8±0.4）℃出現特征峰，且各種擴增產物的解鏈溫度與軟件預測的產物解鏈溫度無顯著差異。試驗結果表明，所設計的引物citrus-trnl F/R對柑桔屬植物表現出較好的通用性。

圖1 植物內參照基因tRNA Leu基因引物對及探針對樣品DNA的Taqman實時熒光PCR擴增結果Fig.1 Amplification results of 14 plants with plant universal primer and probe by Taqman real-time PCR method

圖2 引物對citrus-trnl F/R對7種柑桔屬果實的SYBR Green實時熒光PCR擴增結果Fig.2 Amplification results of 7 citrus plants with citrus-trnl F/R primers by SYBR Green real-time PCR method

2.3 引物特異性

為確定所設計的引物citrus-trnl F/R的特異性，用引物citrus-trnl F/R對梨、蘋果、山楂、香蕉、草莓、葡萄和獼猴桃7種非柑橘屬植物進行實時熒光PCR擴增。結果見圖3。

從圖3可知，引物對citrus-trnl F/R對7種非柑橘屬植物的實時熒光PCR結果均為陰性，說明引物對citrus-trnl F/R的特異性良好。

2.4 檢測靈敏度

從圖4可見，隨著DNA濃度的降低，擴增曲線的Ct值不斷增大。DNA濃度為10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10 pg/μL和1 pg/μL 0.1 pg/μL時，樣品的擴增結果為陽性，擴增曲線的Ct值分別為15.77±0.01、19.90±0.03、24.10±0.05、28.57±0.12和31.75±0.73；DNA濃度為0.1 pg/μL時，兩個平行的結果均為Ct值＞36，擴增曲線呈明顯上升趨勢，參考SN/T1204-2003的結果判斷方法認為該擴增結果為陽性；DNA濃度為0.01 pg/μL時，樣品無形成典型擴增曲線，其擴增結果為陰性。試驗結果表明，本研究所設計的引物對citrus-trnl F/R的實時熒光PCR方法的靈敏度達到0.1 pg/μL柑橘屬植物DNA。

2.5 市售橙汁樣品檢測

對市售的橙汁及橙汁飲料按上述條件提取DNA，并進行實時熒光PCR擴增，結果見圖5。

擴增結果顯示，空白對照、陰性對照和陽性對照均正常；4種100%橙汁（A、B、C、D）和6種橙汁飲料（E、F、G、H、I、J）樣品的擴增結果均為陽性；溶解曲線分析顯示在（79.8±0.4）℃附近出現特征峰。擴增結果表明，所建立的實時熒光PCR方法能有效檢測到果汁中的柑桔屬成分。

圖3 引物對citrus-trnl F/R對7種非柑桔屬果實的SYBR Green實時熒光PCR擴增結果Fig.3 Amplification results of 7 non-citrus plants with citrus-trnl F/R primers by SYBR Green real-time PCR method

注：A.擴增曲線；B.溶解曲線。

圖4 果汁中柑橘屬植物成分實時熒光PCR方法靈敏度的確定Fig.4 Sensitivity of real-time PCR method for citrus component in fruit juice

圖5 果汁中柑桔屬成分檢測結果Fig.5 Detection result of citrus component in fruit juice samples

3 結論

編碼轉運RNA（Transfer RNA）的trn L基因位于植物葉綠體DNA的大單拷貝區。該基因內有一個長約390 bp～615 bp的內含子。該序列的進化情況經深入研究積累了深厚的研究背景[13-14]。同時，該內含子是植物葉綠體DNA中唯一的I型內含子，其保守區與可變區交替所形成了保守的二級結構[15]。由于該序列擁有較高保守性，因此其常與相鄰的trn F基因一起用于系統發育分析以及植物品種鑒定的研究[16-19]。本實驗根據柑桔屬植物trn L基因設計citrus-trnl F/R特異性引物，試驗結果表明該引物具有良好的柑桔屬植物通用性，對柑桔、臍橙、柚子、檸檬、葡萄柚、貢柑和蜜桔7種柑橘屬植物均可擴增出擴增曲線；同時，該引物具有良好的物種特異性，對梨、蘋果、山楂、香蕉、草莓、葡萄、獼猴桃等7種水果均無交叉反應。

所謂的實時熒光PCR就是通過對PCR擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測，實現對起始模板定性和定量的分析。實時熒光PCR技術以其高特異性、靈敏性、可定量、無污染等優點，得到了廣泛的關注，越來越多地被用于食品成分的檢測中[20-22]。本實驗所建立的SYB Green實時熒光PCR方法的靈敏度達到0.1 pg/μL柑橘屬植物DNA，與劉偉紅等[9]所建立的PCR方法的靈敏度10 pg/μL相比高出兩個數量級，表明該方法的靈敏度較高。

本試驗利用citrus-trnl F/R對10種市售橙汁和橙汁飲料樣品中的柑橘屬植物成分進行檢測，所有樣品均能檢測出果汁中的柑桔屬成分。該方法具有特異性強、敏度高等優點，可用于果汁和果汁飲料中柑橘屬植物成分鑒別，為果汁鑒偽研究提供技術參考。

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Real-time Fluorescence PCR Method for the Detection of Citrus Component in Fruit Juice

LIANG Yu-bin，MU Jing-fang，LI Xiao-ming，LIANG De-pei*
（China National Quality Supervision and Testing Center for Food，Guangdong Testing Institute of Product Quality Supervision（Guangdong），Shunde 528300，Guangdong，China）

A real-time fluorescence polymerase chain reaction method using the fluorescence dye SYBR Green and aimed at citrus trn L gene sequence was established for detection of citrus DNA in fruit juice.The citrusspecific primers were designed according to the sequence alignment result between 20 different citrus trn L gene sequences.The citrus component could be detected by the citrus-specific primers with a limit of detection of 0.1 pg/μL DNA.The following detection of 10 fruit juice and beverage samples showed that this method was suitable to identify the citrus component in fruit juice beverage and other relative food and can provide a technique base for research of fruit juice adulteration detection.

fruit juice；citrus component；trnL gene；Real-time PCR；SYB Green

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.16.022

2013-12-05

梁宇斌（1984—），男（漢），碩士，研究方向：食品生物技術。

*通信作者