基因組轉錄調控元件分析方法研究進展

李文茂賈東方許嶸，2

（1.華僑大學生物醫學學院，泉州 362021；2.泉州醫學高等專科學校，泉州 362100）

基因組轉錄調控元件分析方法研究進展

李文茂1賈東方1許嶸1，2

（1.華僑大學生物醫學學院，泉州 362021；2.泉州醫學高等專科學校，泉州 362100）

真核生物的基因表達是一個非常復雜的過程，需要多種轉錄調控元件的協同作用精確調控。全基因組轉錄調控元件的篩選和鑒定對于基因表達調控機制和生物學功能研究具有重要意義。但轉錄調控元件的高效篩選及功能驗證仍是研究人員面臨的主要挑戰。結合近年來轉錄調控元件的研究成果，對基因組中轉錄調控元件的預測、篩選及功能驗證方法做一綜述。

轉錄調控元件 高通量篩選 標志物

諸多生物學功能的實現取決于基因在時間和空間上的特異性表達。真核生物的基因表達調控是一個極其復雜的過程，需要一系列轉錄調控因子和DNA序列精確地相互作用。參與基因轉錄調控的DNA序列稱之為轉錄調控元件（Transcriptional regulatory elements，TREs），主要包括啟動子、增強子、絕緣子等。據估算，哺乳動物基因組中約有5%的DNA序列含有編碼信息，但僅有1.5%的序列能夠編碼蛋白質［1］。最近的研究表明，許多疾病的發生與轉錄調控元件的突變相關，因此，這些非編碼轉錄調控元件的篩選及功能探索對基因表達調控機制和生物學功能研究具有重要意義［2］。

如何對基因組中的TRE進行準確預測，將是研究人員面臨的一個重大挑戰。與固定于基因5'端的啟動子不同，一些調控元件在基因組中位置不固定，如增強子，可以通過遠程相互作用與遠端啟動子相互作用，調控基因表達。對于轉錄調控元件的篩選，傳統的方法是通過比較基因組學尋找物種間同源非編碼DNA保守序列。近幾年，隨著基因芯片技術和高通量測序技術的發展，通過檢測轉錄調控元件的相關表觀修飾物，可以準確、快捷的對TRE進行分析和定位。本研究對近幾年TRE元件的表觀標志物研究及篩選方法進行分析、比較、探索，旨在為相關研究提供參考以及思路。

1 轉錄調控元件指示性表觀修飾物

在基因轉錄調控過程中，除了轉錄調控元件及

轉錄調控因子外，還存在許多表觀修飾信息影響基因表達調控。這些表觀調控信息主要包括：組蛋白修飾、染色質重塑和核小體變形等。組蛋白修飾是其中表觀遺傳調控最重要的內容。在染色質中組蛋白N末端容易受到修飾酶的甲基化、乙酰化等共價修飾。這種組蛋白修飾往往對基因的表達具有很大影響［3］。不同的TRE元件具有不同的組蛋白修飾模式，且多種組蛋白形成修飾組合協同影響基因的表達。不同的轉錄調控元件具有不同的表觀修飾標志物，根據這些標志物可以對相關調控元件在基因組中的位點進行預測和定位（表1）。

表 1 TRE相關指示標志物

1.1 啟動子

研究顯示組蛋白3賴氨酸4三甲基化（H3K4-me3）主要分布于啟動子轉錄起始位點（Transcription strartsite，TSS）周圍，同時在增強子區域也存在［4］。在對胚胎干細胞（Embryonicstem cell，ES）和分化細胞的染色質H3K4me3修飾研究時發現，H3K4me3廣泛存在于所有類型的啟動子中，與啟動子元件存在線性相關性［5，6］。此外，除H3K4me3修飾外，啟動子元件還存在一些其他表觀特征，包括組蛋白乙酰化、H3.3組蛋白變體、DNase I超敏性（DNase I hypersensitivity）及Pol II（RNA-polymerase II）聚合酶結合位點等［7-10］。

不同活性的啟動子元件，其表觀修飾特征也存在一定的差異。一些處于抑制狀態的啟動子元件也具有獨特的染色質修飾特征，如組蛋白3賴氨酸27（H3K27）甲基化、組蛋白3賴氨酸9（H3K9）甲基化等。H3K27三甲基化（H3K27me3）是一種多梳蛋白抑制物，H3K27me3在沉默型啟動子中分布水平要比在活躍啟動子高得多［11-14］。但研究顯示，H3K27me1主要分別在活躍型啟動子中［14］。H3K9的甲基化主要參與異染色質的形成和基因表達沉默［15］。研究表明，H3K9雙甲基化和三甲基化（H3K9me2 和H3K9me3）主要分布在沉默型啟動子的TSS周圍，而單甲基化（H3K9me1）卻分布于活躍型啟動子TSS的周圍［14］。

1.2 絕緣子元件

絕緣子是基因組中阻止增強子活性和異染色質延伸的一種DNA元件。在哺乳動物中，轉錄抑制因子CTCF一種廣泛存在于脊椎動物中的鋅指蛋白，對絕緣子功能發揮的關鍵調控因子，且在染色質環狀結構的形成和穩定方面具有重要作用［16］。在不同的細胞系中，CTCF（CCCTC-binding factor）結合位點具有相同的序列，因此CTCF具有廣泛性，可用于絕緣子元件的篩選［14，17］。

1.3 增強子元件

1.3.1 P300 P300是一種乙酰轉移酶，它與某些特異性轉錄因子，如CREB結合，可以使組蛋白發生乙酰化進而激活基因的轉錄［18］。Heintzman等［19］利用ChIP-chip方法對人基因組中30 Mb區域進行組蛋白修飾等相關研究時發現，P300結合位點的分布情況與增強子在基因組中的分布模式相吻合，且大部分P300結合位點與DNase I位點和基因序列保守區域相重疊。這些證據表明P300和增強子功能之間可能存在著相關性。Visel等［20］運用ChIP-seq技術在小鼠胚胎組織中進行P300結合位點的進一步篩選，將克隆的DNA片段進行轉基因小鼠試驗，證實P300結合位點可精確的鑒定出增強子片段。相比于比較基因組學方法，P300結合位點可以明顯提高增強子預測的精確度，且可以預測出序列保守性較弱的增強子元件［20，21］。因此，P300是一種有效預測增強子的標志物。

1.3.2 組蛋白修飾和增強子的分類 早期對增強子的組蛋白修飾物主要集中在組蛋白3賴氨酸4單甲基化修飾（H3K4me1）上。基因組范圍內的H3K4me1分布模式研究發現，H3K4me1的分布具有高度的細胞特異性，且主要分布于增強子元件區域，可用于增強子元件預測［19，22，23］。但研究顯示，單獨的H3K4me1修飾并不能有效預測所有增

強子元件，一些H3K4me1片段在報告基因驗證中并不具有增強子活性［22］。在對鼠的胚胎干細胞及其他幾種分化細胞的全基因組分析發現，另一種組蛋白修飾H3K27乙酰化（H3K27）與增強子功能元件存在很大相關性［24］。Rada等［25］研究發現，在人胚胎干細胞中也發現了這種相關性。相比沒有發生H3K27ac修飾的增強子，H3K4me1＋和H3K27ac+增強子片段顯然具有更強的基因表達調控活性［24，25］。 在 令H3K27ac-狀 態 的 增 強 子 獲 得H3K27ac修飾后則顯著增強調控基因的表達活性，而增強子元件去H3K27ac修飾或H3K4me1和H3K27ac雙修飾后，基因表達活性顯著下降。因此，H3K27ac修飾對增強子元件功能具有重要影響。Rada等［25］將H3K4me1＋、H3K27ac＋型增強子歸類為活躍型增強子元件，認為這類元件與細胞特異性調控功能相關。而H3K4me1＋、H3K27ac-型增強子可能與細胞分化功能相關，在分化的某個過程中處于靜止狀態等待激活［25］。

此外，在進一步對增強子相關組蛋白標志物研究時發現，一部分沉默型增強子還含有一種甲基化抑制物（H3K27 me3或H3K9me3）。Zentner等［26］根據H3K4me1、H3K27ac、H3K27me3修飾及相關基因表達活性，將增強子元件分為3類：（1）H3K4me1+、H3K27ac+活躍型增強子，參與細胞特異性表達調控；（2）H3K4me1+、H3K27ac-活性較弱型增強子，它參與非特異性細胞功能調控；（3）H3K4me1+、H3K27me3+（H3K9me3+）沉默型增強子，該型增強子在發育過程中起作用。

Ernst等［27］還對增強子相關組蛋白標志物進行了進一步的研究，他們對9種細胞全基因組范圍進行9種組蛋白修飾物的高通量定位分析發現，活躍型增強子分為兩類：一部分增強子含有明顯的 H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3K27ac 和H3K9ac修飾。另一部分則H3K4me1 和 H3K27ac信號很強，但是H3K4me2 和 H3K9ac修飾相對較弱。而對于較弱型和沉默型增強子，H3K4me1的修飾水平較弱。同時，該研究也表明，活躍型增強子與細胞特異性功能調控相關。

以H3K4me1和p300作為單一標志物并不能判斷增強子的表達活性，因此對增強子進行類型劃分非常有必要。通過組蛋白修飾模式，將增強子進行分類，有助于對增強子類型以及增強子活性的預測和篩選。Ernst等［27］的研究發現H3K27me3+沉默型增強子比其他增強子序列上更保守，這也可能解釋了為什么大部分高度保守的序列在報告基因檢測中沒有活性。

1.4 轉錄調控元件的染色質核小體變體特征

真核生物核小體由核心組蛋白八聚體和纏繞的DNA及組蛋白H1組成。含有H3變體H3.3和H2A變體H2A.Z的核小體很不穩定，容易在中性鹽環境中被破壞。通過這些變體可以改變染色質的空間構象和穩定性，影響基因的轉錄。染色質中基因轉錄調控區域普遍認為是一段核小體退化的區域，主要分布在在啟動子、增強子、絕緣子等區域［14，25］。

2 轉錄調控元件篩選方法

2.1 比較基因組學序列保守性分析

比較基因組學方法主要基于這樣的理論：基因組中許多功能序列由于凈化選擇保存下來，而非功能性片段突變對機體的健康的影響微不足道，使得這種突變可以漂移累積。隨著物種間進化發生，發揮重要功能的DNA片段比非功能性片段具有很低的突變率而有序列保守性［28］。因此，同源基因間的序列保守性與序列的功能性之間存在一定的線性相關性［29］。通過算法分析出一定進化距離的物種間同源基因的序列保守性，可用于轉錄調控元件在基因組中分布的預測及定位。已有多種基因組瀏覽器和軟件用于物種間保守非編碼序列篩選，如表2。

表 2 常用保守非編碼序列預測軟件

此外，多個研究組已成功應用這種方法篩選到多種轉錄調控元件［30-33］。

比較基因組學借助計算機進行算法分析，然后對調控元件進行活性篩選，易于進行。且隨著多個

物種基因組測序項目的完成，各物種的基因序列越來越容易獲取。因此比較基因組學日益成為調控元件預測和篩選的重要方法。但由于算法等技術限制，基于比較基因組學的方法并不能篩選出所有功能性調控元件。很多功能性元件并沒有呈現物種間序列保守性［34，35］。根據DNA元件百科全書（Encyclopedia of DNA elements，ENCODE）項目組公布的信息，現已證實約50%的TRE序列沒有顯示序列保守性［36］。此外，研究表明一些保守的非編碼序列并沒有生物學功能［33，37］。因此，單獨根據序列保守性篩選功能性調控元件的成功率較低，并不是一種理想的方法，但可作為功能性調控元件篩選的依據。

2.2 高通量篩選實驗方法

2.2.1 DNase I超敏性和FAIRE DNase I超敏性常用于分析染色質中的相對開放性區域。轉錄調控因子結合到DNA序列上需要形成相對開放的染色質構象，使得這些位點對于DNase I的切割具有非常高的敏感性。這些染色體開放區域常是一些DNA調控元件位點，包括啟動子、增強子、隔離子、絕緣子等。利用DNase I超敏性結合基因芯片技術（DNase-chip）或深度測序技術（DNase-Seq）可應用于全基因組轉錄調控元件的篩選和鑒定［38-40］。與DNaseI超敏性不 同，FAIRE（formaldehyde-assisted identification of regulatory elements）方法則是利用甲醛對染色質進行交聯，通過超聲波對染色質開放區域進行切割［41］。雖然DNase I超敏性和FAIRE不能用于確定具體的TRE類型，但與其他方法相結合可以有效提高TRE的篩選效率。

2.2.2 染色質免疫共沉淀技術（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP） 染色質免疫共沉淀技術是在活細胞狀態下，通過甲醛交聯蛋白質和DNA，并將其隨機切割成小片段。通過某種轉錄因子的特異性抗體富集與目的蛋白結合的DNA片段。傳統的方法是PCR分析富集的DNA片段，該方法很難實現全基因組范圍的高通量研究。Ren等［42］將ChIP技術和基因芯片技術結合（ChIP-chip），實現全基因組范圍轉錄因子的定位和功能分析。近幾年來高通量測序技術的發展，結合ChIP技術發展的ChIP-seq技術被廣泛用于全基因組轉錄調控因子的研究。

基于ChIP-chip/seq等高通量方法可以全基因組范圍定位轉錄調控因子的結合位點，因此被廣泛應用于轉錄調控元件的高通量篩選。如通過ChIP-seq技術繪制全基因組轉錄因子CTCF結合位點，用于篩選絕緣子元件［17］。但ChIP技術需要針對每種轉錄因子的特異性抗體，理論上若在基因組范圍內篩選所有的TRE元件需要制備針對每種轉錄因子的抗體，這是幾乎不可能完成的。但是應用ChIP-chip/seq檢測一些TRE標志性表觀標志物，可以為這一問題的解決提供光明前景。可以依據ChIP-chip/seq技術檢測的相關表觀標志物在基因組中的分布對TRE元件進行分析及預測。

3 轉錄調控元件的功能驗證

DNA片段的轉錄調控活性一般是通過報告基因瞬時轉染的方法進行驗證。將預測的TRE序列插入到熒光素酶報告基因質粒中，瞬時轉染到細胞中，通過檢測熒光素酶報告基因的發光強度，對TRE元件的活性進行對比分析；對于啟動子活性的檢測，是將預測的TRE元件置于報告基因的上游；而增強子活性則是在活性較弱的啟動子元件下進行驗證，絕緣子元件需要置于增強子和啟動子元件之間進行驗證。通過報告基因瞬時轉染法可以高通量篩選分析TRE元件［43-45］，但這種方法也存在一些缺陷。例如，瞬時轉染的質粒不能整合到基因組中，因此DNA片段不能正確呈現出染色質的構象，可能會出現異常表達。其次用于體外培養的細胞不能真實模擬體內環境。

動物模型轉基因分析方法可以克服這些缺點，該方法可以通過顯微操作將質粒隨機整合到受精卵基因組中，通過報告基因在胚胎的表達模式可以檢測插入DNA片段的組織特異性和活性。目前已有多種模式動物中應用于轉基因分析篩TRE元件［46-48］，Pennacchio等［49］更是通過轉基因小鼠分析對人基因組中保守非編碼序列進行高通量分析，篩選出75種增強子序列。但是轉基因分析對實驗室條件要求嚴苛，且實驗成本相比瞬時轉染要高，限制了該方法的廣泛應用。

4 結語

許多TRE在某種類型細胞或發育的某個階段

處于沉默狀態，在進一步的功能驗證中無表達活性。因此，需要有效的手段對相關調控元件基因組中分布位置以及表達活性進行預測分析。比較基因組學、DNaseI 超敏性、FAIRE等方法不具有特異性，不能對TRE的類型進行預測，且不能分析TRE元件的活性狀態。通過ChIP-chip/seq可以實現全基因組范圍篩選，并可對相關的TRE進一步細分。但目前ChIP-chip/seq的分辨率較低，在基因組中分布范圍廣，因此很難確定篩選序列的核心區域。但是通過多種方法的綜合分析及對比驗證，將會大大提高TRE篩選的效率和成功率。

近年來，雖然相關表觀修飾物的研究對TRE篩選具有指導意義，但我們對染色質修飾機制及這些修飾對基因的調控機制仍十分缺乏。同時還有許多的新的表觀修飾物去發現和歸類。因此，隨著篩選技術的發展和相關機制的深入研究，基因調控元件將進一步應用于基因治療等領域的研究中。

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（責任編輯 狄艷紅）

Research Advance in Genome-wide Identification of Transcription Regulatory Elements

Li Wenmao1Jia Dongfang1Xu Rong1，2
（1. School of Biomedical Sciences，Huaqiao University，Quanzhou 362021；2. Quanzhou Medical College，Quanzhou 362100）

Expression of eukaryotic genes is a complex process, achieved through the coordinated action of transcription regulatory elements. The screening and identification of transcriptional regulatory elements in genome scale have crucial significance for understanding the mechanism and biological function of gene expression regulation. However, the effectively screening and function verification is still the major challenges for researchers. Herein, based on the latest research findings, we reviewed the methods of prediction, screening, function analysis of transcription regulatory elements in genome.

Transcriptional regulatory element High throughput screening Biomark

2013-12-26

福建省教育廳科技項目（JA12434），泉州市科技計劃項目（2012Z71）

李文茂，男，碩士研究生，研究方向：肺癌靶向基因治療；E-mail：liwenmao@aliyun.com

許嶸，男，博士研究生，講師，研究方向：基因治療；E-mail：xurong197886@sina.com