分蘗洋蔥查爾酮異構(gòu)酶基因的克隆及表達載體的構(gòu)建

劉丹 吳鳳芝

（東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院，哈爾濱 150030）

分蘗洋蔥查爾酮異構(gòu)酶基因的克隆及表達載體的構(gòu)建

劉丹 吳鳳芝

（東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院，哈爾濱 150030）

旨在得到分蘗洋蔥查爾酮異構(gòu)酶基因，探明該基因的功能。克隆查爾酮異構(gòu)酶基因并構(gòu)建了其超表達和干擾載體，以期得到用于研究查爾酮異構(gòu)酶基因功能的表達載體。從分蘗洋蔥葉片中克隆得到查爾酮異構(gòu)酶基因cDNA 全長743 bp，GenBank登錄號為KJ489062。結(jié)果顯示，該基因633 bp的開放讀碼框編碼210個氨基酸的多肽序列。將PCR 擴增克隆得到的分蘗洋蔥查爾酮異構(gòu)酶基因片段連接到干擾載體pCAMBIA1301和超表達載體SOL2095中，成功構(gòu)建了35S 啟動子控制的植物表達雙元載體pCAMBIA1301-CHI和SOL2095-CHI。

分蘗洋蔥 查爾酮異構(gòu)酶 基因克隆 載體構(gòu)建

黃酮類化合物是多酚類次生代謝物質(zhì)，由苯丙烷代謝途徑合成。黃酮類化合物具有很多重要功能，如紫外防護、抗病原微生物、參與花色形成、植物的育性及植物與微生物相互識別協(xié)作等。查爾酮異構(gòu)酶（Chalcone isomerase，CHI）也稱查爾酮黃酮異構(gòu)酶（Chalcone flavanone isomerase）［1］，是類黃酮物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶之一［2］，可催化分子內(nèi)環(huán)化反應，使雙環(huán)的查爾酮轉(zhuǎn)化為有生物學活性的三環(huán)（2S）-黃烷酮。CHI 蛋白以單體的形式普遍存在于大多數(shù)植物中，分子量因植物組織而異，約24-29 kD［3］。目前，查爾酮異構(gòu)酶基因在幾種植物中已被克隆：如雪蓮［4］、矮牽牛［5］、紫花苜蓿［6］、百合［7］、水稻［8］、馬鈴薯［9］等。CHI 基因表達量的高低不僅對花色影響大，同時也會影響到黃酮類代謝產(chǎn)物的合成。

分蘗洋蔥（Allium cepa var. agrogatum Don.）俗稱毛蔥，為百合科蔥屬草本植物。其適應性強，高產(chǎn)、耐貯、供應期長，是黑龍江省傳統(tǒng)的優(yōu)良農(nóng)家品種，在廣大農(nóng)村多有種植。其鱗莖中含有特殊辛辣味的揮發(fā)性硫化物，具有殺菌消毒作用，亦是類黃酮含量較高的蔬菜種類之一，生產(chǎn)中常被用于間、混、套作，用來減輕連作障礙問題［10］。近年來的研究表明，基因表達產(chǎn)物可通過根系分泌物進入土壤中，進而對土壤生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響［11］。本研究利用基因手段調(diào)控查爾酮異構(gòu)酶的表達，驗證其對土壤微生物群落和多樣性的影響，克隆分蘗洋蔥查爾酮異構(gòu)酶基因，進行序列分析，確定該酶的功能相關(guān)

結(jié)構(gòu)域，并分別構(gòu)建該基因的過表達載體和RNAi表達載體，旨在為進一步探索CHI 基因在分蘗洋蔥中的功能，以及在轉(zhuǎn)基因植物中的應用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料分蘗洋蔥來源于黑龍江省五常市紅七社村。農(nóng)桿菌EHA105、GV3101，植物表達載體包括超表達載體pDONR207、SOL2095，干擾載體pBluescript SK、pCAMBIA1301由本實驗室保存。大腸桿菌DH5α、載體pMD18-T購自大連寶生物公司。試驗于2013年3月-11月在東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院完成。

1.2 方法

1.2.1 3'RACE的擴增 以Trizol法提取分蘗洋蔥葉片總RNA，根據(jù)本實驗室建立的分蘗洋蔥轉(zhuǎn)錄組的測序結(jié)果，在開放閱讀框設計3'引物。FACE1：5'-AGTTTGGCCTGCAAGTAGGATC-3'；FACE 2：5'-GGACAGATTAGTCTCCTATGAC-3'分別與通用引物5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'進行巢式PCR的擴增獲得3'序列。PCR程序為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃ 40 s，35 個循環(huán)；72℃10 min。擴增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)進行拍照及分析。擴增產(chǎn)物按照BioTeke公司的凝膠回收試劑盒的使用說明進行回收。回收目的片段連接到TaKaRa公司pMD18-T載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，進行陽性克隆篩選。陽性克隆由上海生物工程有限公司進行序列測定。

1.2.2 生物信息學分析 將克隆基因測序結(jié)果提交NCBI 進行BLAST 檢索，確認克隆得到了查爾酮異構(gòu)酶基因。蛋白功能結(jié)構(gòu)域、電荷、分子量、等電點等預測分別使用ExPASy蛋白質(zhì)組分析工具（http：//www.expasy.ch/tools/）中的ProtParam（http：// web.expasy.org/protparam/）和NCBI軟件進行分析。

1.2.3 基因的克隆

1.2.3.1 CHI基因cDNA全長的克隆 根據(jù)Gateway克隆技術(shù)設計CHI全長的引物序列，attB1-CHI-F：5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGG AGTCGAAGATGATC-3'；attB1-CHI-R：5'-GGGGACC ACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAGCGTCCGATAAC ATTAATC-3'（下劃線為Gateway的接頭序列）。采用Platinum Pfu DNA 聚合酶，反應條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃ 50 s，35個循環(huán)；72℃10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，進行純化回收。

1.2.3.2 CHI 基因 RNAi 片段的克隆 以Trizol法提取分蘗洋蔥葉片總RNA，使用天根公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 第一鏈。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒根據(jù)生物信息學分析結(jié)果設計 RNAi 引物序列。

CHI-RNAiZ-AttB1-fw：5'-GCTCTAGACGATGCTATTGTGTCTGCTGA-3'（下劃線為Xba I 位點）；CHIRNAiZ-AttB2-nostop-rev：5'-CGGGATCCTCCACCCATGTACCATTTCTGT-3'（下劃線為BamH I 位點）。

CHI-RNAiF-AttB1-fw：5'-CCGGGTACCGATGCT ATTGTGTCTGCTGA-3'（下劃線為Kpn I 位點）；CHIRNAiF-AttB2-nostop-rev：5'-ACGCGTCGACTCCACCC ATGTACCATTTCTGT-3'（下劃線為Sal I 位點）。

PCR反應條件為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃40 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min。用瓊脂糖凝膠電泳檢測反應產(chǎn)物，進行純化回收。

1.2.4 表達載體的構(gòu)建

1.2.4.1 利用Gateway技術(shù)構(gòu)建超表達載體

（1）入門載體的構(gòu)建：BP反應創(chuàng)建Entry載體pDONR207：用回收純化后的帶有接頭的PCR產(chǎn)物與受體載體pDONR207進行重組反應。BP反應體系中包括PCR 產(chǎn)物50-150 ng、pDONR207載體1 μL、5×BP ClonaseTM反應緩沖液2 μL、BP ClonaseTM酶混合物1 μL，補充TE 緩沖液（pH8.0）至10 μL。反應體系置25℃溫育2 h后加入2 μL蛋白酶K溶液，37℃溫育10 min 以終止BP反應。將反應產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至50 μL E.coli DH5α感受態(tài)細胞中。轉(zhuǎn)化后涂布含50 mg/L卡那霉素的LB篩選培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落至5 mL含50 mg/L卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。

（2）LR反應：LR反應的目的在于將已經(jīng)重組入Entry載體的目標基因再克隆到表達載體SOL2095，以產(chǎn)生表達克隆。LR反應體系中包括Entry克隆100-300 ng、SOL2095載體1 μL、5×LR ClonaseTM反應緩沖液2 μL、LR ClonaseTM酶混合物1 μL，補充TE 緩沖液（pH8.0）至10 μL。反應體系

置25℃溫育2 h后加入2 μL蛋白酶K溶液，37℃溫育10 min以終止LR反應，載體構(gòu)建，見圖1。

圖1 SOL2095-CHI 載體構(gòu)建圖

（3）LR反應產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及陽性克隆的鑒定：將LR反應產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α，提取質(zhì)粒。對重組質(zhì)粒進行PCR和測序鑒定，以確定是否構(gòu)建到超表達載體中。

1.2.4.2 RNAi 載體的構(gòu)建 從分蘗洋蔥擴增出CHI保守區(qū)上的337 bp片段，正向片段連 pMD18-T并測序正確后用Xba I和BamH I雙酶切后連入pBluescript SK載體上，進行測序和酶切驗證。酶切驗證后與連有反向片段的pMD18-T載體分別進行Sal I和Kpn I雙酶切，將反向片段回收后連接到同樣酶切的pBluescript SK-F質(zhì)粒上。

當CHI-R反向片段連到上述的pBluescript SK-F重組質(zhì)粒上時，對上述重組質(zhì)粒用Xba I和Kpn I進行雙酶切，切下pBluescript SK-FR目的片段，連到經(jīng)同樣雙酶切的1301質(zhì)粒上，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-FR，并用Xba I和Kpn I雙酶切鑒定CHI-FR是否連到pCAMBIA1301重組質(zhì)粒上，載體構(gòu)建如圖2所示。

2 結(jié)果

2.1 分蘗洋蔥查爾酮異構(gòu)酶基因及序列分析

3' RACE 方法擴增后得到CHI基因大小約 500 bp左右的3'端的目的片段（圖3）。測序后與前期已獲得的片段序列進行拼接，獲得了CHI 基因的全長cDNA序列（圖4）。通過對序列中起始、終止密碼子以及各可能的ORF比較，該序列大小為743 bp（GenBank登錄號KJ489062），其中包括ATG起始密碼子、TAA 終止密碼子。開放讀碼框共633個堿基，編碼210個蛋白。經(jīng)NCBI查詢，該基因與荷蘭鳶尾（Iris×hollandica，GenBank登錄號KJ192336.1）、石斛蘭（Dendrobium，GenBank登錄號KC345013.1）、花生（Arachis hypogaea，GenBank登 錄 號JN412735）、 金 銀 花（Lonicera japonica，GenBank登錄號JX068610.1）具有較高的同源性，分別為79%、78%、76%和75%，因此可認定獲得的基因為CHI，將其命名為AcadCHI。

2.2 AcadCHI 預測蛋白的生物信息學分析

分蘗洋蔥CHI 基因的開放閱讀框為1-633 bp區(qū)域，編碼一條含210個氨基酸的蛋白質(zhì)。軟件在線分析顯示多肽分子量為23.7582 kD，等電點pI值為4.86，原子總數(shù)為3 358，分子式為C1068H1689N267O325S9，不穩(wěn)定系數(shù)為38.47，為穩(wěn)定性蛋白。將分蘗洋蔥CHI氨基酸序列輸入到NCBI網(wǎng)站中分析，結(jié)果（圖5）表明，在其第1-210位氨基酸構(gòu)成一個結(jié)構(gòu)域，高度保守結(jié)構(gòu)域為第115-132位氨基酸。

圖2 pCAMBIA1301-CHI 載體構(gòu)建圖

2.3 分蘗洋蔥AcadCHI基因超表達載體的構(gòu)建

將利用Gateway技術(shù)構(gòu)建的超表達載體，測序結(jié)果（圖6）顯示，帶有B序列接頭的AcadCHI全長基因的序列進行測序PCR反應，對反應產(chǎn)物進行純化后，結(jié)果（圖6）顯示，AcadCHI全長基因兩端

已經(jīng)加入了B序列接頭，并且讀碼框正確，未發(fā)生 移碼現(xiàn)象，說明超表達載體構(gòu)建正確。

圖5 AcadCHI蛋白結(jié)構(gòu)功能域的分析

圖6 含B序列接頭的AcadCHI 的核苷酸序列

2.4 分蘗洋蔥AcadCHI基因干擾片段的克隆及載體構(gòu)建

2.4.1 正、反義片段的克隆及重組子的鑒定 以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA第一鏈為模板，分別進行正向、反向插入片段擴增，擴增產(chǎn)物長度均為337 bp（圖7，圖8）。重組質(zhì)粒pMD-F和pMD-R分別用Xba I /BamH I及Sal I /Kpn I雙酶切，均可切下337 bp的目的片段（圖9），且測序結(jié)果正確，說明載體pMD-F和pMD-R構(gòu)建成功。

圖7 AcadCHI-F的擴增

圖8 AcadCHI-R的擴增

2.4.2 pBluescript SK-F及pBluescript SK-FR質(zhì)粒重組子鑒定 重組質(zhì)粒pBluescript SK-F用Xba I/BamH I雙酶切，在337 bp處得到目的條帶（圖10），表明pKA-F載體已構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒pBluescript SK-FR分別用Sal I /Kpn I雙酶切（圖11），337 bp處有目的條帶，表明pBluescript SK-FR載體構(gòu)建成功。

2.4.3 pCAMBIA1301-RNAi-CHI質(zhì)粒重組子的鑒定 重組質(zhì)粒pBluescript SK-FR用Xba I /Kpn I雙酶切，在957 bp左右處得到目的條帶（圖12），說明

載體構(gòu)建成功，將酶切的片段和pCAMBIA1301載體用Xba I /Kpn I雙酶切得到的片段進行連接，構(gòu)建得到載體pCAMBIA1301-RNAi-CHI。

圖9 pMD-F和pMD-R酶切鑒定

圖10 pBluescript SK-F酶切鑒定

圖11 pBluescript SK-FR酶切鑒定

將重組質(zhì)粒用Xba I/Kpn I進行雙酶切得到957 bp左右的目的條帶（圖13），表明RNAi 載體pCAMBIA1301-RNAi-CHI已經(jīng)構(gòu)建成功。

3 討論

查爾酮異構(gòu)酶是黃酮類化合物代謝途徑的一個關(guān)鍵酶，因此，近年來該酶也成為黃酮代謝調(diào)控工程研究的一個熱點酶。Muir等［12］發(fā)現(xiàn)查爾酮異構(gòu)酶（Chalcone isomerase，CHI）是黃酮類代謝途徑中的早期酶，也是增加黃酮醇產(chǎn)物的關(guān)鍵酶。本研究首次從分蘗洋蔥通過 RT-PCR法克隆得到cDNA，全長約743 bp。該基因編碼210個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，是一個完整的CDS，GenBank登錄號為KJ489062，多肽分子量為23.7582 kD，等電點pI值為4.86。這與已登錄的大部分常見物種的CHI大小基本一致，該基因與荷蘭鳶尾、石斛蘭、花生和金銀花具有較高的同源性，分別為79%、78%、76%和75%，確定為查爾酮異構(gòu)酶基因。

圖12 pBluescript SK-FR 酶切鑒定

圖13 pCAMBIA1301-CHI-FR 酶切鑒定

Gateway克隆技術(shù)克服了傳統(tǒng)的酶切和連接方法構(gòu)建載體的種種缺陷，能夠?qū)⒒蚋咝У乜寺〉揭粋€或多個與Gateway克隆技術(shù)兼容的載體系統(tǒng)中［13］，利用Gateway技術(shù)構(gòu)建的載體具有高拷貝數(shù)的復制起點，可以滿足大規(guī)模的克隆操作的需求［14］。RNAi 技術(shù)因其具有高效特異和操作簡便的特點已經(jīng)成為基因功能研究中一項有力的工具，以其高度專一性和有效的干擾特性使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低的突變體，此技術(shù)已廣泛應用到水稻［15］、擬南芥［16］等的載體構(gòu)建中。本研究成功構(gòu)建了控制植物表達的干擾載體pCAMBIA1301-CHI和超表達

載體SOL2095-CHI。首次克隆百合科蔥屬植物分蘗洋蔥的CHI基因并構(gòu)建了其表達載體。通過兩種載體的成功構(gòu)建，可以直接用于農(nóng)桿菌介導的植物轉(zhuǎn)化，并為下一步試驗奠定了基礎(chǔ)。

目前對CHI基因的研究很多，主要運用在外源CHI基因的表達來提高黃酮類物質(zhì)［4，5］、改變花色［17］等研究上，利用基因手段調(diào)控查爾酮異構(gòu)酶的表達，改變植物土壤微生物多樣性的研究還鮮有報道。本研究應用RACE 法克隆了CHI基因，構(gòu)建了35S啟動子驅(qū)動的CHI 基因的超表達和干擾兩個組成型表達載體，下一步會將CHI基因轉(zhuǎn)化到植物中進行表達和功能鑒定，期望能為實際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

從分蘗洋蔥葉片中克隆得到查爾酮異構(gòu)酶基因cDNA全長743 bp，GenBank登錄號KJ489062。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該基因633 bp 的開放讀碼框編碼210個氨基酸的多肽序列。將PCR擴增得到的分蘗洋蔥查爾酮異構(gòu)酶基因片段連接到表達載體中，成功構(gòu)建了35S 啟動子控制的植物表達雙元載體pCAMBIA1301-CHI干擾載體和SOL2095-CHI超表達載體。

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（責任編輯 馬鑫）

Cloning of Chalcone Isomerase Gene from Potato Onion and Plant Expression Vector Construction

Liu Dan Wu Fengzhi
（Horticulture College，Northeast Agricultural University，Harbin 150030）

To clone and analyse the function of the potato onion chalcone isomerase gene, we generated CHI over-expression construct and RNAi construct. Full-length CHI gene is 743 bp, and the GenBank accession number is KJ489062. Results showed that, CHI gene open reading frame contain 633 bp, translating into 210 amino acids. Full-length CHI gene and the fragment of CHI gene for silencing were amplified by PCR on complementary DNA（cDNA）, then PCR fragment was transferred to the binary vector under the control of 35S.

Potato onion Chalcone isomerase Gene cloning Vetor construction

2014-04-28

國家自然科學基金項目（31172002）

劉丹，女，博士研究生，研究方向：植物分子生物學；E-mail：mdjliudan@126.com

吳鳳芝，女，博士，教授，研究方向：設施園藝與蔬菜生理生態(tài)；E-mail：fzwu2006@aliyun.com