轉PcRS基因擬南芥的抗炭疽病研究

柳忠玉趙樹進

（1.長江大學生命科學學院，荊州 434025；2.廣州軍區廣州總醫院，廣州 510010）

轉PcRS基因擬南芥的抗炭疽病研究

柳忠玉1趙樹進2

（1.長江大學生命科學學院，荊州 434025；2.廣州軍區廣州總醫院，廣州 510010）

為確定虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.）白藜蘆醇合酶基因PcRS（Polygonum cuspidatum resveratrol synthase）提高植物抗病性的有效性，以轉PcRS 基因擬南芥為材料，對其進行了分子鑒定和抗炭疽病（Colletotrichum higginsianum）研究。利用Southern blot和 Northern blot 驗證了外源PcRS基因在轉基因擬南芥基因組中的整合和表達。對經過選育得到的T3代純合株系進行離體的抗病性試驗。轉基因擬南芥甲醇提取物對炭疽病菌具有明顯抑制作用。進一步采用點滴法接種生長 4 周的轉基因擬南芥離體葉片，與野生型植株相比，轉基因植株葉片壞死斑直徑和壞死斑上的孢子數目都顯著減少，表明轉基因擬南芥通過抑制孢子的繁殖來限制炭疽病菌的定植，從而提高轉基因植株對炭疽病的抗性。

虎杖 白藜蘆醇合酶 轉基因擬南芥 炭疽菌 抗病性

虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.）是蓼科多年生草本植物，根或根莖入藥，是重要的白藜蘆醇藥源植物之一。白藜蘆醇及其糖苷具有抗腫瘤、抗衰老、保護心血管系統等廣泛的生物學功能［1-3］。白藜蘆醇合酶（Resveratrol synthase，RS）是白藜蘆醇生物合成途徑中的關鍵酶之一，在花生（Arachis hypogaea L.）、葡萄（Vitis vinifera L.）、大黃（Rheum tataricum L.）、高粱（Sorghum bicolor L.）、川鄂爬山虎（Parthenocissus henryana （Hemsl.）Diels et Gilg）中的白藜蘆醇合酶基因相繼被克隆［4-7］。基因組測序顯示，葡萄中的白藜蘆醇合酶基因以基因家族的形式存在，白藜蘆醇合酶基因高達43個，其

中20個已經被表達［8］。

現有的研究表明，白藜蘆醇合酶基因在提高植物抗病性或改良作物品質方面有良好的應用前景。來源于花生的白藜蘆醇合酶基因導入苜蓿（Medicago sativa L.），可提高苜蓿對莖點霉病（Phoma medicaginis）的抗性［9］；該基因轉入地黃（Rehmannia glutinosa L.），則增強了地黃對尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）的抗性［4］。將葡萄的白藜蘆醇合酶基因導入小麥，增強了轉基因小麥對葉銹病（Puccinia recondite）和穎枯病（Septoria nodorum）的抗性［10］；該基因導入番木瓜后，轉基因的番木瓜增強了對疫霉菌（Phytophthora palmivora）的抗性［11］。但是，有些植物過量表達白藜蘆醇合酶基因后，雖然體內積累了白藜蘆醇或白藜蘆醇苷，然而對病原菌的抗性并沒有提高。例如，在轉基因獼猴桃中白藜蘆醇苷含量達182 μg/g鮮重，但對灰霉菌（Botrytis cinerea）的抗性沒有提高［12］；轉基因白楊的白藜蘆醇苷含量高達615.2 μg/g鮮重，但對葉銹病（Melampsora pulcherrima）的抗性沒有改變［13］。目前，白藜蘆醇合酶基因增強植物抗病性的機理尚不清楚，白藜蘆醇合酶基因家族成員的多樣性使得其作用機制更為復雜。

本實驗室前期已克隆了虎杖的白藜蘆醇合酶基因PcRS（Polygonum cuspidatum resveratrol synthase），構建了植物表達載體pCAMBIA1380-35S-PcRS，通過轉基因獲得了表達PcRS 的擬南芥T1代，研究證實過量表達PcRS可促進轉基因擬南芥中白藜蘆醇苷的合成［14］。但PcRS基因過量表達能否提高植物抗病性尚不清楚。

本研究以轉基因擬南芥T1為材料，連續多代種植。對篩選得到的T3代純合株系，通過體外抑菌活性檢測和離體抗病性試驗進行抗炭疽病研究，旨在為進一步剖析PcRS基因在防御應答炭疽病侵染過程中的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 以野生型擬南芥為受體，利用重組表達載體pCAMBIA1380-35S-PcRS 進行轉化，所得到的轉基因擬南芥 T1代，由本實驗室培育。

1.1.2 菌株 供試病原真菌炭疽病菌（Colletotrichum higginsianum）由華南農業大學植物病理實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 轉基因植株的Southern雜交 對經潮霉素抗性篩選為陽性的植株進行Southern 雜交檢測。取10 μg基因組DNA，經EcoR I 酶切DNA。以引物P1（5'-CCGGTACCATGGCAGCTTCAACTGAAG-3'）和P2（5'-CCGGATCCTTAAATGATGGGCACACTTC-3'）擴增PcRS基因作為探針模板，探針標記、雜交及檢測參照作者已經建立的方法［14］進行。

1.2.2 轉基因植株的Northern 雜交檢測 提取擬南芥葉片總RNA，用甲醛變性凝膠進行電泳，之后將凝膠中的RNA 轉移至尼龍膜上，交聯5 min固定RNA。以上述引物P1和P2擴增的PcRS基因作為探針模板，探針標記、雜交及檢測參照作者已經建立的方法［14］進行。

1.2.3 轉基因植株甲醇提取物的體外抑菌試驗 生長速率法測定植物甲醇提取物的抑菌活性，參照文獻［15］方法進行，所有器皿及試劑均無菌。選取生長狀態一致的轉基因及野生植株葉片，置于電熱恒溫干燥箱中以50℃烘干并粉碎。稱取一定重量的植物材料干粉，加入10倍體積（V/W）的甲醇，置于避光陰涼處，每次浸提持續24 h，重復浸提3次，合并浸提液，旋轉蒸發儀減壓濃縮至質量濃度為1 g/mL。在無菌條件下，配制提取物干粉濃度為100 mg/mL的水溶液，用移液槍吸取1 mL到裝有9 mL已融化PDA培養基（溫度約60℃）的三角瓶中，充分搖勻，再倒入90 mm的培養皿中制成質量濃度為10 mg/mL 的含藥培養基平板，接種炭疽菌菌餅（Φ=5.0 mm）。每處理重復3次。28℃培養7 d，再用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑菌率。

抑菌率（%）=［（對照菌落直徑-0.5）-（處理菌落直徑-0.5）］/（對照菌落直徑-0.5）×100%

1.2.4 轉基因擬南芥的離體抗病性鑒定 將炭疽菌接種在PDA上于28℃培養7 d，挑取黃色孢子團懸浮于無菌水中，制備105-106個孢子/ mL的孢子懸浮液。采用點滴法接種鑒定抗病性，將生長4周的擬南芥葉片剪下，用滅菌水清洗 3 次，分別置于墊

有濾紙保濕的容器中，再滴加10 μL孢子懸浮液于離體葉片上，28℃、相對濕度95%以上的培養箱培養7 d后，測定壞死斑直徑。以野生型擬南芥為對照，重復3次。參照文獻［16］方法測定壞死斑內孢子的數目。結果數據用SPSS19 進行統計分析。

2 結果

2.1 PcRS基因的整合與表達

經過潮霉素抗性篩選得到轉基因擬南芥T1代株系L3、L4、L5、L6、L7、L8和L15。提取葉片的基因組DNA，經過EcoR I完全酶切，以PcRS基因特異片段為探針，并通過 Southern blot方法檢測PcRS在植物基因組中的整合情況。雜交結果表明，所檢測的7個轉基因株系中，全部都有明顯的雜交信號，而野生型擬南芥無任何雜交信號，表明外源T-DNA（圖1-A）已經整合到轉基因擬南芥的基因組中。外源PcRS基因拷貝數介于1-7之間，其中轉基因擬南芥株系L4、L6和L15為單拷貝整合，株系L3、L5、L7和L8為多拷貝整合，其中株系L8 的拷貝數最高（圖1-B）。

為了分析外源基因PcRS在轉基因植株中的表達情況，分別提取擬南芥植株葉片的總RNA，進行Northern blot分析。結果（圖1-C）顯示，野生型擬南芥植株無任何雜交信號；外源基因PcRS在轉基因擬南芥株系L4、L5、L6、L7和L15中均有表達，但是高拷貝整合株系L3、L8無任何雜交信號，說明外源基因PcRS在株系L3和L8中發生基因沉默。

選取單拷貝轉基因株系L4和L6連續2代種植，篩選得到穩定遺傳的T3代純合子株系，以T3代純合子株系為材料進行后續的抗病性試驗。

2.2 轉基因擬南芥甲醇提取物抑菌活性測定

為了驗證PcRS基因的過量表達是否能提高擬南芥對炭疽病的抗性，將炭疽病菌接種在含不同株系甲醇提取物的 PDA 培養基上，培養7 d后發現，在含野生植株甲醇提取物的PDA培養基上，菌落直徑較大，而在含轉基因植株甲醇提取物的PDA培養基上菌落直徑明顯減小（圖 2-A）。從抑制率來看（圖2-B），在10 mg/mL的濃度下，兩個轉基因株系甲醇提取物對炭疽病菌均有抑制作用，平均抑菌率分別達到55.2%和50.3%，二者的抑菌率無顯著差異。結果初步證明，在體外抑菌試驗中過量表達PcRS基因的擬南芥可以較好地抑制炭疽病菌的生長。

圖 2 轉基因植株體外抑菌試驗

2.3 轉基因擬南芥離體葉片對炭疽病的抗性

在抗病性鑒定試驗中，采用點滴法接種轉基因擬南芥的離體葉片，以野生型擬南芥為對照。野生型擬南芥離體葉片接種炭疽病菌孢子懸浮液后，第3天葉片開始失綠并出現壞死點，7 d后葉片發黃并且形成大的壞死斑。而轉基因擬南芥葉片失綠不明顯，7 d后出現較小的壞死斑。分析接種后7 d的葉片壞死斑直徑。結果（圖3-A，圖3-B）顯示，轉基因擬南芥株系L4和L6在接種7 d后，壞死斑直徑的平均值顯著小于野生型擬南芥，L4和L6之間的差異不顯著。

進一步統計壞死斑內炭疽病菌的孢子數目，與野生型植株相比，轉基因植株葉片壞死斑上的孢子數目顯著減少（圖3-C）。這表明轉基因擬南芥通過抑制孢子的繁殖來限制炭疽病菌的定植，從而提高轉基因植株對炭疽病的抗性。說明PcRS基因的超表達增強了轉基因擬南芥對炭疽病菌的抗性。

圖 3 轉基因植株離體葉片對炭疽病的抗性測定

3 討論

JA）等的關鍵信號分子的調控。例如，乙烯是植物與病原物互作中的一個重要的信號分子，是植物基礎抗性所必需的，同時它也能誘導植物的抗病反應。雖然植物細胞中白藜蘆醇生物合成的信號調控機制還不清楚，但相關研究表明脅迫激素，如乙稀、水楊酸、茉莉酮酸等確實能誘導RS mRNA在葡萄［20，21］或花生［22］葉片中累積。在擬南芥中防衛反應中，受SA信號調控的抗性相關基因有PR1（Pathogenesis-related protein）、PR2（b-1.3-glucanase）和 PR5（Thaumatin-like）等［23］。受ET、JA信號調控的抗性相關基因有PDF1.2（Plant defensin 1.2）、PR3（basic chitinase）和PR4（chitinase type I and II）［24］。我們推測轉基因擬南芥增強了炭疽病抗性：一方面可能是由于外源PcRS 基因的組成型表達直接導致抗病性增強；另一方面可能是外源PcRS 基因與擬南芥自身防御基因發生了直接或間接的互作，激發了更強的抗病反應。所以后續試驗可開展對PR1、PR2、PR5、PDF1.2、PR3和PR4等相關基因表達分析，探討其協同抗病機制。

4 結論

本研究以轉PcRS 基因擬南芥為材料，對其進行了分子鑒定和抗炭疽病研究。體外抑菌試驗和離體抗病性檢測結果表明，PcRS基因過量表達可提高轉基因擬南芥對炭疽病的抗性。

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（責任編輯 馬鑫）

Studies on the Resistance of Transgenic Arabidopsis Overexpressing PcRS to Colletotrichum higginsianum

Liu Zhongyu1Zhao Shujin2
（1. College of Life Sciences，Yangtze University，Jingzhou 434025；2. General Hospital of Guangzhou Military Command，Guangzhou 510010）

In order to reveal the effectiveness of Polygonum cuspidatum resveratrol synthase（PcRS）gene in increasing tolerance to pathogenic microorganisms in foreign species, the PcRS transgenic Arabidopsis was used as material to identify its molecular characterization and study its resistance to Colletotrichum higginsianum. Integration and expression of transgene in the genome of Arabidopsis was confirmed by Southern blot and Northern blot analyses. Independent homozygous transgenic Arabidopsis lines with genetical stability were obtained after the selection of T3progenies and tested in vitro for disease resistance to C. higginsianum. Agar-plate bioassays were used to test the extracts of transgenic Arabidopsis for antifungal activity against C. higginsianum. Results showed that the mycelial growth of C. higginsianum was greatly inhibited. Then the detached leaves of 4-week-old Arabidopsis plants were used to inoculate. The lesion diameter and spore production significantly reduced on transgenic Arabidopsis. Overexpression of PcRS in transgenic Arabidopsis could restrict colonization of C. higginsianum by inhibition of spore production, resulting in enhanced resistance against C. higginsianum.

Polygonum cuspidatum Resveratrol synthase Transgenic Arabidopsis Colletotrichum higginsianum Disease resistance

2014-01-03

長江大學博士啟動基金項目（801100010122），廣東省自然科學基金項目（10151001002000012）

柳忠玉，女，博士，講師，研究方向：生物制藥；E-mail：zyliu2004@126.com

趙樹進，教授，博士生導師，研究方向：生物制藥；E-mail：gzzsjzhs@163.com