鹽脅迫下沙冬青細胞端粒酶活性的變化與DNA穩定性的關系

張徐俞王瑾瑜鄭廣順張俊琦盧存福

（1.北京林業大學生物科學與技術學院 分析測試中心 林木育種國家工程實驗室，北京 100083；2.清華大學分析測試中心，北京 100084；3.中國科學院植物研究所，北京 100093）

鹽脅迫下沙冬青細胞端粒酶活性的變化與DNA穩定性的關系

張徐俞1王瑾瑜2鄭廣順3張俊琦1盧存福1

（1.北京林業大學生物科學與技術學院 分析測試中心 林木育種國家工程實驗室，北京 100083；2.清華大學分析測試中心，北京 100084；3.中國科學院植物研究所，北京 100093）

沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）是亞洲中部荒漠地區的常綠闊葉灌木，是古老的第三紀孑遺植物，具有極強的抗逆能力。旨在探究鹽脅迫下沙冬青細胞端粒酶活性變化與染色體DNA穩定性的關系。結果表明，在100 mmol/L NaCl的低濃度鹽脅迫處理下，隨著處理時間的增加，端粒酶活性沒有增加，未出現明顯的DNA降解現象；當在500 mmol/L高濃度鹽脅迫時，處理的初期端粒酶活性迅速的增加，但隨著處理時間的延長，端粒酶活性下降，此時DNA未明顯降解；當移除NaCl脅迫，端粒酶活性增加1.4倍，DNA保持穩定。因此推測，在鹽脅迫下，沙冬青細胞端粒酶活性的維持對避免細胞遭受不可逆損傷，保持染色體DNA穩定性具有一定的作用。

沙冬青 鹽脅迫 端粒酶 DNA損傷

植物在生長發育中時常受到不良環境脅迫的影響，如鹽漬、干旱、低溫等，其中鹽害在世界許多地區存在，嚴重影響農林業生產。鹽脅迫對植物造成的損傷主要包括滲透脅迫和離子毒害，而這兩種原初反應的結果，即產生活性氧（reactive oxygen species，ROS）［1］，活性氧具有很強的氧化能力，低濃度ROS則能誘導某些抗氧化酶基因的表達，提高酶活性，從而消除活性氧；高濃度ROS可直接作用

于 DNA，使細胞核內DNA降解［2］。DNA損傷直接導致與細胞維持生理功能的某些基因失去表達活性，進而導致細胞衰老［3］。Allsopp等［4］的研究表明，活性氧可以使DNA單鏈斷裂積累并導致端粒縮短。

端粒酶是具有逆轉錄活性的核糖核蛋白，具有維持端粒長度，保護和修復DNA損傷，維持細胞活力的功能［5］。在對人和動物的研究表明，由細胞凋亡所引起的DNA損傷可在端粒酶的作用下修復。在細胞受到外界刺激而造成細胞內DNA斷裂等損傷時，端粒酶逆轉錄酶基因（TERT）則大量表達，修復DNA損傷，但其修復能力具有一定的限度［6，7］。煙草細胞中也存在同樣的修復現象，煙草細胞在受到重金屬鎘脅迫時發生凋亡，染色體濃縮且DNA發生片段化，但是如果能夠及時地移除這種脅迫，這種凋亡是可以修復的，并且這種修復同端粒酶活性的上升或維持有一定的關聯性［8］。

沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）是我國西北荒漠地區的常綠灌木，是亞熱帶地區第三紀殘遺物種，具有較強的抵抗干旱、寒冷、高溫、鹽堿等的特性，并已被確定為國家三級保護樹種［9，10］。沙冬青自然分布的地區含鹽量高達0.38%，其種子在濃度低于1.2% NaCl溶液中可以正常發芽，幼苗在0.9%鹽濃度下生存良好，因此沙冬青具有很強的耐鹽堿的特性，是植物抗逆研究的理想材料［11］。有關沙冬青抗逆分子機理的研究，目前主要集中在抗逆基因的克隆和功能驗證［12-14］，但逆境脅迫下染色體DNA穩定性與抗逆能力關系的研究，還未見報道。本研究通過對沙冬青細胞進行鹽脅迫處理，檢測在不同濃度鹽脅迫下染色體DNA的穩定性及端粒酶活性的變化，旨在探討端粒酶對維持逆境脅迫下染色體DNA穩定性可能所起的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

沙冬青懸浮細胞：在 40 mL沙冬青液體培養基中（B5+1.0 mg/mL 6-BA+1.0 mg/mL NAA），按照1∶5的比例加入沙冬青細胞進行懸浮培養。培養13 d，每2 d取樣一次，稱重，確定生長特性。

1.2 方法

1.2.1 鹽脅迫處理 將沙冬青懸浮細胞在含NaCl 0、 100、300和500 mmol/L的培養基中培養3 d，然后再轉入不含鹽的培養基中培養3 d。每天取一次樣。

1.2.2 TTC法測定細胞活力 參照劉華等［15］TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）法測定紅豆杉細胞活力的方法，取100 mg不同濃度鹽處理的沙冬青愈傷加入離心管中，將愈傷用鑷子夾碎，在離心管中加入3 mL的TTC溶液，用錫箔紙包好避光，放22℃培養箱中培育12 h。用槍頭吸去TTC溶液，加入蒸餾水洗2-3次。離心機500×g離心3 min，收集細胞，然后加入3 mL 95%的酒精，懸浮細胞。置入60℃水浴鍋水浴10 min，冷卻至室溫后定容至3 mL，搖勻。分光光度計測定其在485 nm處的吸光值。

1.2.3 端粒酶蛋白提取和檢測 端粒酶的組成成分中含有RNA，極容易被降解，因此，應該和提取RNA一樣，盡量在低溫條件下快速操作、必須使用RNase-free的耗材、桌面最好用固相RNase清除劑清潔。

參照Fitzgerald等［16］的方法，稱取0.3 g鹽處理后的沙冬青懸浮細胞，將材料放入預冷的研缽中迅速研磨，加入預冷的CHAPS buffer 800 μL，放在冰浴中裂解30 min，4℃ 16 000×g 離心20 min，離心后在超凈臺中取上清，加入10% W/V PEG8000［17］，放在冰上沉淀30 min，每隔3-5 min顛倒混勻一次，16 000×g離心10 min，去上清，再在沉淀中加入CHAPS裂解液200 μL，在冰上靜置裂解30 min，然后繼續4℃ 16 000×g離心10 min，-80℃保存。12%聚丙烯酰胺膠電泳，熒光染料染色，用自動電泳凝膠成像分析儀進行掃描，Quality one軟件分析條帶。

1.2.4 DNA損傷的檢測 提取沙冬青細胞DNA，用瓊脂糖凝膠電泳及EB染色測定DNA穩定性，紫外透射儀下觀察DNA 條帶，用自動電泳凝膠成像分析儀進行掃描。

2 結果

2.1 沙冬青懸浮細胞培養及生長特性

為了確定沙冬青懸浮細胞的繼代時間，將沙冬青愈傷組織放入40 mL液體培養基中（B5+1.0 mg/mL 6-BA+1.0 mg/mL NAA），繼代兩次后，再將其按照1∶5比例繼代到新培養基中，隔天測定細胞鮮重，得到S型生長曲線。繼代3 d后，沙冬青懸浮

細胞進入對數生長期，7 d后進入到靜止期（圖1）。

圖1 沙冬青懸浮細胞生長曲線

2.2 鹽脅迫下沙冬青懸浮細胞活力

將懸浮培養10 d的沙冬青懸浮細胞分別繼代于含0、100、300和500 mmol/L NaCl的液體培養基中，25℃，130 r/min懸浮培養3 d，每天取樣，3 d后將懸浮細胞轉入不含鹽的培養基中再懸浮培養3 d，每天取樣，測定6 d中所取細胞的細胞活力。

由圖2可知，沙冬青懸浮細胞的相對活力隨著生長時間的增長不斷的增大。100 mmol/L NaCl處理的沙冬青懸浮細胞的相對活力，在鹽脅迫的3 d中，其活力不斷的下降，一旦移除鹽脅迫的條件，細胞活力有所上升。300 mmol/L NaCl處理的沙冬青懸浮細胞的相對活力，在鹽脅迫的3 d中，其活力迅速地減小，移除鹽脅迫后，細胞活力雖然有所回升，但很快又出現下降趨勢。500 mmol/L NaCl處理的沙冬青懸浮細胞與300 mmol/L NaCl處理的變化趨勢基本相當，但是其下降的趨勢較300 mmol/L NaCl處理要迅速。在移除脅迫后，也沒有迅速的回升。由此可知，在鹽脅迫下，沙冬青懸浮細胞活力隨著鹽濃度的增加下降速度也越快，一旦移除脅迫條件后，低濃度的鹽脅迫下，細胞活力會回升。

圖2 鹽脅迫處理下沙冬青懸浮細胞活力變化

2.3 鹽脅迫下DNA的穩定性

沙冬青懸浮細胞在鹽脅迫后，通過瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA降解程度。結果（圖3）顯示，在0 mmol/L NaCl處理下，剛繼代的懸浮細胞能檢測到不太明顯的DNA，基本檢測不到DNA拖尾條帶。在300 mmol/L和500 mmol/L NaCl處理下，出現輕微DNA拖尾條帶，移除NaCl脅迫后，DNA 拖尾反而變得較明顯，但主帶仍很清晰，在點樣孔中有明顯殘留，可能是由于蛋白或其它雜質沒有去除干凈，且其條帶主帶較其它帶明顯，可能DNA濃度較大，導致雜質較多，出現拖尾現象。這些結果表明，在鹽脅迫及移除鹽脅迫的恢復期，染色體DNA由于遭受損傷加速降解。

圖3 瓊脂凝膠電泳檢測沙冬青懸浮細胞在不同濃度鹽脅迫下DNA穩定性

2.4 鹽脅迫下沙冬青懸浮細胞端粒酶活性的變化

同測定細胞活力一樣，選擇了4個鹽濃度（0、100、300和500 mmol/L NaCl）來處理沙冬青懸浮細

胞，處理時間和處理方式都與細胞活力測定保持一致。在沒有鹽脅迫的情況下，端粒酶活性隨著細胞的生長基本保持穩定。100 mmol/L NaCl處理下，端粒酶活性比沒有鹽脅迫的要高，而移除脅迫后端粒酶活性緩慢增加。當NaCl的濃度增加到300和500 mmol/L時，在處理的初期端粒酶活性迅速增加，但隨著處理時間的延長，端粒酶活性下降，一旦移除脅迫，端粒酶活性恢復到對照或超過對照水平（圖4，圖5）。

圖4 不同濃度鹽脅迫下沙冬青懸浮細胞端粒酶活性的變化

3 討論

植物在整個生長發育周期中都會受到外界各種生物或非生物脅迫，這些傷害會對植物造成或大或小的損傷，包括生長抑制、光合作用下降、能耗增加，衰老甚至死亡［18］，而對于細胞最直接的是其DNA損傷，導致細胞凋亡［19］。擬南芥中由端粒縮短引起的細胞死亡是有某種類凋亡方式來完成的，這個機制可以通過染色體端粒片段檢測獲得［20］。在對人的研究中發現，端粒酶可以通過增加細胞分裂和減少細胞凋亡來增加細胞的壽命，同時端粒酶可以調節DNA損傷應答，保證染色體末端DNA的穩定性［21］。Fojtova等［8］對煙草細胞進行鎘脅迫研究表明，在3 d脅迫處理時間內，端粒酶活性一直增加，在移除鎘脅迫的3 d恢復期，端粒酶活性增加，細胞DNA損傷也獲得修復，細胞恢復活力；但一旦超出3 d這一臨界點，細胞DNA損傷就不能被修復，走向衰亡。因此，這也證明了端粒酶在細胞DNA損傷修復中起到了很重要的作用。

圖5 沙冬青懸浮細胞在不同濃度鹽脅迫下端粒酶相對活性的變化

本研究中，無論是低鹽（100 mmol/L NaCl）還是高鹽濃度（500 mmol/L NaCl）處理下，隨著處理時間的增加，均未出現明顯的DNA降解現象；低鹽濃度處理下，端粒酶活性較對照組高，而在500 mmol/L高濃度鹽脅迫時，處理的初期端粒酶活性迅速的增加，但隨著處理時間的延長，端粒酶活性下降，但DNA未明顯降解；當移除500 mmol/L NaCl脅迫，端粒酶活性及DNA保持穩定。因此推測，在鹽脅迫下，沙冬青細胞維持高的端粒酶活性對避免細胞遭受不可逆損傷，保持染色體DNA穩定性可能具有一定的作用。

目前，植物端粒酶參與細胞凋亡修復的機制依然不是很清楚，研究報道極其有限。但前人及本研究暗示，深入研究端粒酶逆轉錄酶在植物非生物脅迫抗性損傷修復中的作用，可能會為揭示植物抗逆分子機理提供一條新的路徑。

4 結論

在低鹽和高鹽脅迫下，沙冬青細胞DNA都沒

有出現明顯的降解現象；端粒酶活性在100 mmol/L NaCl的低濃度鹽脅迫處理下無明顯變化，而在 500 mmol/L高濃度鹽脅迫時，在處理初期端粒酶活性迅速增加，但隨著處理時間的延長，端粒酶活性下降，當移除脅迫，端粒酶活性迅速增加。沙冬青細胞端粒酶活性的維持對避免細胞遭受不可逆損傷，維持染色體DNA的穩定性具有一定的作用。

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（責任編輯 馬鑫）

Effects of Salt Stress on Telomerase Activity in Relation to DNA Stability of Ammopiptanthus mongolicus Cells

Zhang Xuyu1Wang Jinyu2Zheng Guangshun3Zhang Junqi1Lu Cunfu1
（1. College of Biological Sciences and Biotechnology，Analysis and Testing Center，National Engineering Laboratory for Tree Breeding，Beijing Forestry University，Beijing 100083；2. Analysis and Testing Center，Tsinghua University，Beijing 100084；3. Institute of Botany，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100093）

Ammopiptanthus mongolicus, the evergreen broadleaf shrub indigenous to the northwest desert of China, is a residual plant of the ancient subtropical area in the Tertiary Period and has been identified as the national tertiary protection species. This research was conducted to explore the relationship between DNA damage and telomerase activity of Ammopiptanthus mongolicus cells under salt stress. The results showed that telomerase activity was increased during the first 3 d of low salt（100 mmol/L NaCl）treatment. However, when culture cells were treated with 500 mmol/L NaCl, telomerase activity increased rapidly at the initial stage, while declined after 2 day salt stress. Telomerase activity increased 1.4-fold in the recovery phase when 500 mmol/L NaCl was removed from the growth medium. DNA damage was not obvious during the NaCl treatment time or in the phase when NaCl was removed from the growth medium. It is proposed that plants might have developed a highly efficient DNA repair system to cope with transient salt stress, and telomerase may play an important role in it.

Ammopiptanthus mongolicus Salt stress Telomerase DNA damage

2014-03-12

高等學校學科創新引智計劃資助項目（B13007），長江學者和創新團隊發展計劃資助項目（IRT13047），北京市教委共建項目（101009）、北京市公園管理中心課題（0710016），北京市自然科學基金項目（6112016）

張徐俞，女，碩士研究生，研究方向：植物端粒、端粒酶；E-mail：zhang545437383@163.com

盧存福，男，教授，研究方向：植物分子細胞生物學；E-mail：lucunfu@bjfu.edu.cn