苜蓿夜蛾促前胸腺激素基因的克隆與原核表達

周夏 郭博智 高艷玲 趙奎軍 樊東

（東北農業大學農學院，哈爾濱 150030）

苜蓿夜蛾促前胸腺激素基因的克隆與原核表達

周夏 郭博智 高艷玲 趙奎軍 樊東

（東北農業大學農學院，哈爾濱 150030）

促前胸腺激素（Prothoracicotropic hormone，PTTH）是一類重要的昆蟲激素，它對昆蟲生長、蛻皮、變態、滯育具有重要調控作用。以苜蓿夜蛾5齡幼蟲為材料提取總RNA，利用RT-PCR和RACE技術，擴增得到苜蓿夜蛾促前胸腺激素基因的cDNA序列，該序列含有823個堿基，包括1個681個堿基的開放閱讀框，編碼1個含226個氨基酸的蛋白，分子量約為26.3 kD，等電點為8.51。序列分析表明，苜蓿夜蛾PTTH的氨基酸序列與其他昆蟲，尤其是鱗翅目夜蛾科昆蟲的PTTH高度同源。獲得的基因已登錄GenBank，登錄號為JF731347。利用原核表達載體pET21b在大腸桿菌中成功表達了苜蓿夜蛾PTTH基因，并用Ni-NTA親和層析柱將帶His-tag的目的蛋白進行純化。

苜蓿夜蛾 促前胸腺激素 基因序列克隆 原核表達

促前胸腺激素（Prothoracicotropic hormone，簡稱PTTH）是由大腦神經分泌細胞產生，刺激前胸腺分泌蛻皮酮的神經肽類激素，對昆蟲的生長發育、蛻皮、變態、滯育［1-3］等起到重要的調控作用。作為第一個在無脊椎動物中發現的激素，PTTH的研究始于1922年，由波蘭學者Kopec通過對舞毒蛾Lymantria dispar幼蟲蛻皮前進行結扎、摘除腦的試驗發現昆蟲形態變化受腦控制，他將其命名為腦激素［4］。1940年Wigglesworth在長紅獵椿Rhodnius prolixus中發現腦激素是由腦神經分泌細胞產生的［5］。隨后Williams于1947年以惜古比天蠶的滯育蛹為材料，證明這種腦激素具有促進前胸腺分泌蛻皮激素誘導變態的作用，所以把腦激素改稱為PTTH［6］。近年來對PTTH的研究不斷深入，對家蠶神經肽促

前胸腺激素研究發現，家蠶PTTH基因mRNA的發育表達變化可能與其調控蛻皮激素合成的功能有關［7］。為了明確PTTH受體及其作用機制，Rewitz等［8］發現果蠅前胸腺特異性表達的Torso基因編碼PTTH受體［9］，而非之前人們猜測的G-蛋白偶聯受體。2012年王秋實等［10］從柞蠶中克隆得到血清素受體B（5HTRB），利用RNA干擾技術把5HTRB基因的dsRNA注射進入蟲體，導致柞蠶滯育的終止，同時發現PTTH表達量增加，證明5HTRB可以抑制PTTH的合成，從而推測其可能是柞蠶的PTTH受體。為了研究PTTH對滯育蛹的作用，Mizoguchi等［11］于2013年研究發現甘藍夜蛾Mamestra brassicae非滯育蛹化蛹后血淋巴中PTTH滴度維持在較高水平，而滯育蛹化蛹后PTTH滴度降到很低水平；相反化蛹后滯育蛹腦中PTTH表達量比在非滯育蛹腦中表達量高。這說明滯育蛹的腦中PTTH的表達量較高，但不釋放到血淋巴中。在立即注射PTTH后滯育蛹被誘導而化蛹，因此蛹滯育被證實是由于PTTH的分泌終止造成的。

1990 年Kawakami等［12］用分子克隆的方法第一次得到全長的家蠶PTTH分子，并證實具有活性的家蠶PTTH是一個糖基化的同源二聚體，通過一個分子間和三個分子內的二硫鍵構成［13］。目前已經在煙芽夜蛾Heliothis virescens AY172671［14］，棉鈴蟲Helicoverpa armigera AY286543［3］，谷實夜蛾Helicoverpa zea AY172670［15］，煙實夜蛾Helicoverpa assulta AY780526，甜菜夜蛾Spodoptera exigua AY780527［16］，甘藍夜蛾AB748456［11］，家蠶Bombyx mori NM_001-043884，煙草天蛾Manduca sexta AY007724［17］，惜古比天蠶AF288695［18］，柞蠶U62535［19］，日本柞蠶Antheraea yamamai AY461435中成功克隆得到PTTH基因，這些基因的獲得為PTTH的深入研究提供了依據。

苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca屬鱗翅目，夜蛾科，主要危害豆科植物，如大豆、苜蓿等。苜蓿夜蛾以幼蟲直接取食為害，其分布廣泛，已成為大豆田中的重要食葉性害蟲。本研究克隆苜蓿夜蛾PTTH，獲取基因cDNA全長序列，并對該基因在大腸桿菌中的表達進行研究，旨在為進一步利用該基因從分子水平防治苜蓿夜蛾奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源 利用黑光燈在田間誘集苜蓿夜蛾成蟲，室內飼以5%蜂蜜水使其產卵，并用未接觸任何農藥的新鮮豆葉做飼料喂養到5齡幼蟲備用。

1.1.2 菌株、質粒及主要試劑 受體菌DH5α、BL21、表達載體pET21b由本研究室保存。RNA提取試劑盒TRIzol?Reagent（購自Invitrogen公司）；反轉錄酶M-MLV Reverse Transcriptase、T4 DNA連接酶、低熔點瓊脂糖（購自Fermentas（FBI）公司）；克隆載體pMD18-T、DNA 膠回收試劑盒、DL2000 DNA Marker、TaKaRa 5'-Full RACE Kit（購自TaKa-Ra公司）；蛋白Marker和Ni-NTA親和層析柱購于北京全式金公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成 按照TRIzol?Reagent試劑說明提取已進行饑餓處理12 h的苜蓿夜蛾5齡幼蟲的總RNA，進行純度和完整性鑒定后放入-80℃冰箱中備用。以dt-R0-Ri（表1）為cDNA合成引物，利用反轉錄酶M-MLV合成cDNA。最終產物保存于-20℃冰箱中。

1.2.2 引物設計與合成 本研究所用引物及用途見表1，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2.3 PCR產物克隆、鑒定及序列測定 比較煙蚜夜蛾（AY172671）以及棉鈴蟲（AY286543）兩種昆蟲PTTH基因的cDNA序列，設計1對適用于克隆苜蓿夜蛾PTTH基因cDNA序列的部分片段的引物：PTTH 和antiPTTH（表1）。PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環；72℃延伸10 min，PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收，與pMD18-T vector連接、轉化到E.coli DH5α培養、雙酶切鑒定。連接正確的重組子由哈爾濱博仕生物技術公司進行序列測定。

1.2.4 利用RACE技術克隆cDNA全長序列 根據得到的基因片段設計PTTH 3'端cDNA序列的引物PTTH3' Ro和PTTH3' Ri（表1）。用PTTH3' Ro與3'-Ro進行Outer PCR，電泳檢測后，用PTTH3' Ri和3'-Ri對Outer PCR產物進行巢式PCR擴增，然后進行3'RACE產物電泳分離檢測、克隆和測序，方法

同上。

表1 本試驗中所用引物

5' RACE反應按照TaKaRa 5' Full RACE Kit說明書，合成cDNA第一鏈，用PTTH 5' Ro和試劑盒提供的5'-RACE Outer Primer進行第一輪擴增，然后以擴增產物為模板，用PTTH 5' Ri和5'-RACE Inner Primer（表1）進行巢式PCR擴增，最后5' RACE產物進行電泳分離檢測、克隆和測序，方法同上。

進入21世紀以來，通過“數字黃河”工程建設、水質自動監測體系建設、黃河水資源保護重大問題研究等，水資源保護現代化水平和科技支撐能力不斷提高。

對以上幾個反應獲得的序列片段進行拼接，獲得PTTH的全長序列，根據全長序列設計克隆基因全長序列的引物PTTHF和PTTHR（表1），一次性克隆全長序列。

1.2.5 序列分析 用BioXM2.6軟件對獲得的cDNA序列進行翻譯；利用ExPASy 網站（http：//us. expasy.org/tools/dna.html）蛋白分析軟件推導氨基酸序列的分子質量、等電點和結構域；SignalP 4.1 Server進行信號肽的預測；CFSSP軟件進行二級結構的預測；SWISS-MODEL服務器進行自動建模（Automate Mode），預測該蛋白的三維結構；同源性比較采用NCBI中的BLAST工具；進化樹構建采用ClustalX、MEGA4.1軟件。

1.2.6 苜蓿夜蛾PTTH基因原核表達及純化 用引物PTTH EcoR I（含EcoR I酶切位點）和PTTH Xho I（含Xho I酶切位點）（引物序列見表1）進行PCR擴增，反應結束后產物電泳檢測并回收。對回收產物和表達載體pET21b分別進行雙酶切，產物回收后使用T4連接酶16℃過夜連接，構建表達載體pET21b-PTTH，并轉至DH5α感受態細胞中。藍白斑篩選出陽性克隆，搖菌、測序、提取質粒，用EcoR I和Xho I雙酶切鑒定并測序驗證，鑒定正確的重組質粒轉至BL21中。使用IPTG誘導表達，SDS-PAGE凝膠電泳檢測，表達之后使用Ni-NTA親和層析柱純化帶His-tag的目的蛋白。

2 結果

2.1 苜蓿夜蛾PTTH的cDNA序列

利用RT-PCR和RACE獲得了苜蓿夜蛾PTTH的cDNA全長序列（圖1）。序列大小為823個堿基，開放讀碼框編碼226個氨基酸的多肽（圖2），分子量為26.3 kD，等電點為8.51。核苷酸序列在GenBank登錄，登錄號為JF731347。

圖1 苜蓿夜蛾PTTH全長cDNA序列的PCR擴增產物

2.2 PTTH基因編碼蛋白質的氨基酸序列特征分析

利用Expasy molecular biology server的Scanprosite facility對推導的苜蓿夜蛾促前胸腺激素氨基酸

的結構域進行預測。推導得到的苜蓿夜蛾促前胸腺激素氨基酸序列含有一個N-位糖基化位點和一個O-位糖基化位點。SignalP4.0進行信號肽分析時發現PTTH推導的氨基酸在28和29位之間存在一個信號肽切割位點。含有PTTH特有的7個半胱氨酸殘基。通過CFSSP軟件預測PTTH蛋白的二級結構，預測結果（圖3）顯示，β-折疊和α-螺旋是其最主要的二級結構元件，其次是無規則卷曲和β-轉角。預測得到PTTH蛋白的三維結構（圖4）。

圖2 苜蓿夜蛾PTTH基因核苷酸序列及推導的氨基酸序列

圖3 苜蓿夜蛾PTTH蛋白的二級結構

圖4 PTTH蛋白的三級結構

氨基酸序列比對結果表明，苜蓿夜蛾PTTH與其他登錄GenBank的昆蟲PTTH序列一致性達60%以上，其中與煙芽夜蛾（AY172671）、棉鈴蟲（AY286543）一致性最高，達92%，與谷實夜蛾（AY172670）、煙實夜蛾（AY780526）、甜菜夜蛾（AY780527）、甘藍夜蛾（AB748456）的一致性分別為91%、91%、75%和73%（圖5）；聚類分析表明苜蓿夜蛾PTTH與夜蛾科昆蟲PTTH親緣性相對較近，與非夜蛾科的鱗翅目昆蟲的親緣關系相對較遠。苜蓿夜蛾與煙蚜夜蛾同源性最高，其在分類學上屬

于同一個屬Heliothis；而谷實夜蛾、棉鈴蟲和煙實夜蛾所在屬Helicoverpa與苜蓿夜蛾所在屬Heliothis是近緣屬，所以苜蓿夜蛾PTTH與這3個昆蟲PTTH的同源性相對較高（圖6）。

圖5 不同昆蟲PTTH氨基酸序列的多重比對

2.4 PTTH基因的原核表達分析

原核表達結果（圖7）表明，含非重組載體pET21b的BL21經誘導后未檢測到目的條帶，而含目的基因的重組載體pET21b-PTTH的BL21經IPTG誘導后，在26.3 kD左右出現特異性蛋白表達條帶，與預測的蛋白質分子量接近。利用Ni-NTA親和層析柱純化蛋白，從圖7中5、6泳道可以看出，用咪唑緩沖液可以把目的蛋白洗脫出來，證明獲得較高純度的重組蛋白。

3 討論

本試驗克隆得到一條苜蓿夜蛾促前胸腺激素的cDNA序列，通過與其他昆蟲PTTH基因進行同源性

比較，可以明顯看出苜蓿夜蛾PTTH基因與鱗翅目4個夜蛾科昆蟲煙蚜夜蛾、棉鈴蟲、煙實夜蛾和谷實夜蛾的同源性較高，而與家蠶、柞蠶、惜古比天蛾和日本柞蠶同源性較低。事實上，苜蓿夜蛾與煙芽夜蛾在分類學上屬于同一個屬Heliothis，所以同源性最高；而苜蓿夜蛾所在屬Heliothis與谷實夜蛾、棉鈴蟲和煙實夜蛾所在屬Helicoverpa是近緣屬，所以苜蓿夜蛾PTTH與這3個昆蟲PTTH的同源性相對較高；苜蓿夜蛾與甜菜夜蛾、甘藍夜蛾雖然同屬夜蛾科，但所在屬是非近緣屬，所以同源性相對較低；同理苜蓿夜蛾與其他鱗翅目非夜蛾科昆蟲PTTH同源性更低。

圖 6 利用鄰接法構建的鱗翅目不同種類昆蟲的PTTH基因系統進化樹

圖7 苜蓿夜蛾PTTH SDS-PAGE 電泳結果

構建的原核表達載體pET21b-PTTH在37℃誘導表達，經SDS-PAGE分離，在大腸桿菌中高效表達出融合蛋白，但為包涵體蛋白。該表達系統能否表達出可溶性蛋白可通過進一步的條件優化進行探討或者利用其他真核表達系統進行研究。表達蛋白的獲得為下一步制備單克隆抗體及其生理功能研究奠定基礎。

Xu等［16］在分析甜菜夜蛾PTTH mRNA不同時期表達量發現，mRNA在幼蟲期有一定的表達，并且在齡末升高；在化蛹初期有高表達，蛹中期維持在一定的表達水平，蛹末期則不斷增加，羽化前達到較高的表達水平；甜菜夜蛾幼蟲期和蛹期的PTTH含量變化和蛻皮變態的周期是完全一致的，顯示出PTTH在甜菜夜蛾行使其生物學功能很可能也是通過刺激前胸腺合成和分泌蛻皮激素來完成的。本研究后續工作將圍繞PTTH調節機制展開，明確不同發育階段、不同時間、不同光周期對苜蓿夜蛾PTTH及蛻皮激素表達量的變化，進而研究兩者之間的關系。同時可通過RNAi技術手段研究苜蓿夜蛾PTTH的合成與釋放，設計相應的藥物分子控制害蟲的生長發育，通過分子生物學手段以達到高效、綠色控制苜蓿夜蛾的目的。

4 結論

獲得苜蓿夜蛾PTTH cDNA全長，序列含有823個堿基，包括一個681個堿基的開放閱讀框，編碼一個含226個氨基酸的蛋白，分子量約為26.3 kD，等電點為8.51。GenBank登錄號JF731347。同源序列比對發現，苜蓿夜蛾PTTH氨基酸序列與其他昆蟲高度同源。構建了原核表達載體pET21b-PTTH，在大腸桿菌（BL21）中成功表達并獲得了純化的目的蛋白。

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（責任編輯 馬鑫）

Molecular Cloning and Prokaryotic Expression of Prothoracicotropic Hormone cDNA Sequence from Heliothis viriplaca

Zhou Xia Guo Bozhi Gao Yanling Zhao Kuijun Fan Dong
（College of Agriculture，Northeast Agricultural University，Harbin 150030）

Prothoracicotropic hormone（PTTH）is a group of important insect hormones. They have vital effect on regulation of growth, ecdysis, metamorphosis and diapause of insects. Total RNA was isolated from the fifth instar larvae of Heliothis viriplaca. The cDNA sequence was cloned by RT-PCR and rapid amplification of cDNA ends（RACE）. The cDNA sequence was 823 base pairs in length and contained an open reading frame of 681 base pairs, encoding for a polypeptide of 226 amino acid residues, with a predicted molecular weight of 26.3 kD and pI 8.51. Sequence analysis showed that the predicted amino acid shared extensive similarities with those from other insects, especially the lepidopteran noctuid insects. The cDNA sequence has been deposited in GenBank with accession No. JF731347. The cDNA sequence was successfully expressed by the recombinant prokaryotic expression vector pET21b in E. coli. The recombinant protein with His-tag was purified by Ni-NTA affinity chromatography.

Heliothis viriplaca Prothoracicotropic hormone cDNA cloning Prokaryotic expression

2014-03-27

國家現代農業產業技術體系建設專項基金項目（CARS-04）

周夏，女，碩士研究生，研究方向：昆蟲生物化學與分子生物學；E-mail：dnzhouxia@163.com

樊東，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：昆蟲生物化學與分子生物學；E-mail：dnfd@163.com