家蠅伴侶蛋白TCP-1基因的序列分析、克隆及誘導表達

趙學軍 國果 吳沁怡 陶如玉 吳建偉

（貴陽醫學院基礎醫學院，貴陽 550004）

家蠅伴侶蛋白TCP-1基因的序列分析、克隆及誘導表達

趙學軍 國果 吳沁怡 陶如玉 吳建偉

（貴陽醫學院基礎醫學院，貴陽 550004）

旨在對EST篩選得到的家蠅伴侶蛋白TCP-1（MD-TCPⅠ）基因進行序列分析，克隆其cDNA序列并在大腸桿菌中誘導表達。采用EST測序技術從已構建的家蠅幼蟲cDNA質粒文庫中篩選到MD-TCP Ⅰ基因，對其進行序列測定和分析。以該基因的cDNA文庫質粒為模板，通過PCR的方法進行擴增，以pET-28a（+）為載體構建重組質粒，再轉化到表達宿主大腸桿菌BL21（DE3）中，IPTG誘導表達。表達產物通過SDS-PAGE進行鑒定。結果顯示，MD-TCP Ⅰ基因ORF全長753 bp，編碼250個氨基酸，理論分子量27.07 kD；等電點5.92，該序列編碼的蛋白屬于熱休克蛋白60家族的TCP。構建了正確基因序列MD-TCP Ⅰ重組表達質粒，重組蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導表達。

家蠅 TCP 序列分析 基因克隆 表達

伴侶蛋白是一大類在生物大分子折疊、組裝及降解過程中起著重要的協同作用，但自身并不發生任何變化的存在于生物體內的蛋白質分子［1］。熱休克蛋白60（HSP60）是HSPs類分子伴侶，是一種與細胞應激損傷關系密切的蛋白質，廣泛存在于原核及真核細胞中。HSP60在正常細胞中表達很低，但是在高溫、缺氧、感染、創傷等因素刺激下表達增強，對提高細胞耐受應激的能力，維持細胞內環境的穩定具有重要作用［2］。TCP屬于HSP60家族，是一種廣泛存在于細胞漿中的異型寡聚蛋白，也是迄今為止真核細胞胞漿中發現的唯一一個伴侶素［3］。研究發現正常條件下，HSP60以穩定狀態存在于細胞質

和線粒體基質中；應激條件下，HSP60 迅速從胞質中轉移到線粒體基質以修復線粒體基質中的變性蛋白［4］，并且TCP能與蛋白因子結合形成目標蛋白［5］。

家蠅Musca domesitca是世界性廣泛分布的衛生昆蟲，從幼蟲到成蟲均生活在骯臟的環境中，表現出較強的環境適應能力，所以家蠅必然具有完善而高效的免疫防御機制，我們對此產生了極大的興趣。目前對家蠅熱休克蛋白的研究報道主要是熱休克蛋白70［6］和小分子量熱休克蛋白［7］，對其TCP蛋白的研究尚未見報道。本研究克隆MD-TCPⅠ基因，并對其序列進行生物信息學的分析，同時建立MD-TCPⅠ體外表達系統，旨在為進一步研究MDTCPⅠ特性和有效利用功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 文庫、菌種及質粒 家蠅3齡幼蟲全長cDNA質粒文庫的構建和EST測序及Unigene 分析由北京華大合作完成。原核表達質粒pET-28a（+）和大腸桿菌BL21（DE3）由中山大學引進本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑及工具酶 Ex Taq酶（含dNTP），EcoRⅠ、HindⅢ、T4 DNA連接酶，DNA 標準（DL 2 000 Marker）均購自大連寶生物工程公司；異丙硫代β-D半乳糖苷（IPTG）購自美國Promega公司；DNA凝膠回收試劑盒、質粒純化試劑盒購自北京鼎國生物。

1.1.3 引物合成和DNA測序 基因擴增引物合成由Invitrogen上海生物技術有限公司完成，重組質粒DNA測序上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 家蠅TCP基因Ⅰ（MD-TCPⅠ）的識別及序列測定 對測定得到的家蠅3齡幼蟲EST序列進行Blastx分析，從中篩選獲得編碼家蠅TCPⅠ基因的文庫質粒（編號為004-E08），命名為MD-TCPⅠ。

1.2.2 MD-TCPⅠ基因的生物信息學分析 利用瑞士生物信息學研究所的蛋白分析專家系統（Expert protein analysis system，ExPASy）提供的生物信息學工具，分析預測蛋白質的理化性質、信號肽、跨膜區、二級結構及三級結構。

1.2.3 MD-TCPⅠ基因的擴增 根據已獲得的MDTCPⅠ編碼序列，利用DNA Club和Primer5.0設計引物。上游引物：5'-GCGGAATTCATGGCTTCAATT AGTTTATTGAATC-3'（下劃線為EcoRⅠ酶切位點）；下游引物：5'-CCGAAGCTTTTATAGAAGAAACCCAG AGTT-3'（下劃線為Hind Ⅲ酶切位點）。

以家蠅3齡幼蟲cDNA文庫中MD-TCPⅠ基因的質粒為模板，PCR擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃ 1 min，59℃ 1 min，72℃ 1 min，共35個循環；72℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳回收。

1.2.4 重組原核表達質粒（pET-28a（+）-MD-TCPⅠ）的構建及鑒定 將PCR產物和原核表達質粒pET 28a（+）經EcoRⅠ、HindⅢ 雙酶切后回收，連接并轉化大腸桿菌BL21/DE3感受態細胞，卡那霉素篩選陽性克隆，對陽性克隆提取質粒進行PCR，雙酶切和測序鑒定。

1.2.5 MD-TCPⅠ基因在大腸桿菌BL21/DE3中的誘導表達 取1 mL培養過夜的陽性克隆菌液，加入含有卡那霉素的100 mL LB培養基中（菌液/培養基為1/100），37℃ 220 r/min振搖至OD600=0.4-0.6時，加入IPTG至終濃度4 mmol/L，誘導表達6 h。離心收集菌體，進行超聲破碎。超聲破碎沉淀和上清各自取20 μL，各加入50 μL 1×SDS- PAGE上樣緩沖液，煮沸5 min，13 000 r/min離心1 min，取沉淀和上清5 μL進行SDS -PAGE電泳分析。

2 結果

2.1 序列分析

MD-TCPⅠ基因與蔥蠅的同源基因氨基酸序列的一致性可達89%，ORF全長753 bp，編碼250個氨基酸（圖1），預測分子量為27.07 kD，理論等電點（pI值）5.92。Inter ProScan 分析顯示其具有TCP-1家族的氨基酸保守結構域（圖2）。

信號肽預測 將MD-TCPⅠ氨基酸序列在丹麥技術大學生物序列分析中心（CBS）的網站（http：//www. cbs.dtu.dk/servies/SingnaIP/）進行在線分析，結果顯示，氨基酸序列無信號肽。

TMHMM（Http：//www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0）預測MD-TCPⅠ基因無跨膜區。

圖1 MD-TCPⅠ開放閱讀框cDNA序列及對應編碼的氨基酸序列

圖2 MD-TCPⅠ結構域預測

利用SOPMA網站預測MD-TCPⅠ基因編碼蛋

白的二級結構，發現其二級結構主要有4種類型，分別為α-螺旋占42.40%，β-折疊占7.20%，延伸鏈占21.60%，無規則卷曲占28.80%（圖3）。利用ExPASy網站上提供的SWISS-MODEL對該基因的編碼蛋白進行三級結構的預測，可清楚地看到該蛋白具有豐富的α-螺旋結構，延伸鏈和無規則卷曲也較明顯（圖4），從而驗證了SOPMA網站對其二級結構的預測。

圖3 MD-TCPⅠ二級結構分析結果

圖4 MD-TCPⅠ的三級結構

2.2 MD-TCPⅠ基因擴增及原核重組質粒的鑒定

MD-TCPⅠ基因經PCR擴增后，獲得了750 bp左右的特異條帶（圖5泳道1）。將重組質粒進行雙酶切鑒定，產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結果（圖5泳道3）顯示，重組質粒雙酶切后，在750 bp左右有一清晰的條帶，與目的基因的大小基本相符，提示重組質粒構建成功。將挑選的陽性克隆子送上海生工生物工程有限公司，進一步以pET-28a（+）的通用引物對重組質粒測序，結果表明相應的插入序列與目的基因cDNA序列一致，證明MD-TCPⅠ基因原核表達重組質粒構建成功。

圖5 MD-TCPⅠ的克隆及酶切簽定

2.3 目的基因表達產物的SDS-PAGE鑒定

取重組菌誘導前后的表達產物和超聲破碎沉淀、上清進行SDS-PAGE，結果發現誘導的重組菌約在31 kD左右出現表達條帶，與目的蛋白預測的分子量（27.07 kD）加上所帶His標簽分子量（約3 kD）基本相符，而未誘導菌無此條帶。超聲破細胞后顯示該蛋白在包涵體大量表達箭頭所指（圖6）。

圖6 重組質粒pET-28a（+）- MD-TCPⅠ在大腸桿菌的表達產物SDS-PAGE電泳分析

3 討論

分子伴侶不僅使胞內蛋白折疊、組裝與轉運幫助蛋白［8］，還可以成為感染性疾病中的免疫優勢抗原，激發宿主體內的體液免疫反應和細胞免疫反應，已經證實在細菌或寄生蟲感染中具有免疫保護作用，表明分子伴侶有可能用作疫苗來抵抗微生物感染，或者用來治療腫瘤和自身免疫性疾病［9］。分子伴侶與腫瘤有著密切的聯系，在腫瘤發生中扮演著很重要的角色，既可以促進腫瘤細胞的自主增殖，又可以抑制細胞的凋亡［10］。食管癌的侵襲轉移了能力與HSP27呈負相關，HSP27高表達的食管癌其侵襲轉移能力受到抑制［11］。研究發現，TCP伴侶蛋白

是進化上最為保守的蛋白質之一，由“背靠背”堆疊的雙環狀亞基構成，每個環有8個不同的亞基［5］。TCP伴侶蛋白在肌動蛋白、微管蛋白的組裝和折疊中發揮著重要的作用，TCP伴侶蛋白翻譯機制中的促進其它蛋白正確折疊，為細胞環境如細胞信號介導、細胞增殖等密切關系提供了佐證［12］。TCP的異常會導致細胞骨架蛋白發生改變，甚至影響細胞骨架的形成與聚集［13］。蔥蠅的蛹期冷馴化，TCP-1基因會明顯的上調，使蛹對環境溫度有更高的耐受性，增強昆蟲的抗寒的能力［14］。對二化螟幼蟲熱脅迫時，可引起二化螟幼蟲體內產生氧化應激反應，顯著提高子幼蟲血淋巴細胞內熱休克蛋白水平［15］。CCT6A下調表達能顯著抑制結腸腫瘤細胞的遷移和侵襲能力［16］。此外，TCP伴侶蛋白在視網膜感覺神經元的形成和生成扮演著重要的功能，是神經系統退行性病變的一個潛在的因素［17］。TCP伴侶蛋白在卵泡生長發育中也起著重要的作用［18］。

4 結論

將家蠅TCPⅠ基因片段克隆到原核表達載體pET-28a（+）中，構建重組質粒pET-28a（+）/ MD-TCPⅠ，獲得的重組質粒經過酶切、PCR和測序鑒定，證實含有目的基因片段，重組質粒轉化入大腸桿菌BL21/DE3，IPTG誘導表達，電泳顯示重組蛋白條帶清晰，表明重組蛋白得到了高效表達。

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（責任編輯 馬鑫）

Sequence Analysis，Cloning and Induced Expression of Chaperonin Gene in Housefly（Musca domesitca）

Zhao Xuejun Guo Guo Wu Qinyi Tao Ruyu Wu Jianwei
（School of Basic Medical Sciences，Guiyang Medical College，Guiyang 550004）

The aim of this study is to analyze and predict the structural and characteristics of genes and encoding proteins of MD-TCPⅠ（Musca domesitca Chaperonin TCP- 1（MD-TCPⅠ））, with the methods of cloning and expressing that gene. Sequence analysis indicated that the open reading frame was 753 bp, encoding a putative protein consisting of 250-amino acids, which no signal sequence and NCBI-BLAST showed acid sequence identify with other insect TCP-1 were 89%. The protein, with a predicted molecular weight of 27.07 kD, and pI of 5.92, which acid sequence as tcp-1 belong to HSP60 family. The gene coding for MD-TCP Ⅰwas amplified by polymerase chain reaction（PCR）, and then was ligated into vector pET-28a（+）and transformed into Escherichia coli BL21（DE3）competent cell, induced with IPTG. The fusion protein in the expression vector was analyzed by SDA-PAGE. The results indicated that the recombinant plasmid with the correct target gene was constructed, and the fusion protein was expressed in E. coli BL21（DE3）.

Musca domestic TCP Sequence analysis Gene cloning Express

2014-02-20

國家自然科學基金項目（81160204，81360254），貴州省科技廳基金項目（黔科合［2010］3160），高校博士點學科專項科研基金項目（20105215120001）

趙學軍，男，碩士研究生，研究方向：醫學寄生蟲的分子免疫；E-mail：383657226@qq.com

國果，女，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：昆蟲免疫；E-mail：guoguojsc@163.com