苦參堿對HaCaT細胞Bcl－2/Bax和Fas/FasL的調控

牟寬厚 周 艷韓 丹 穆 欣

·論著·

苦參堿對HaCaT細胞Bcl－2/Bax和Fas/FasL的調控

牟寬厚 周 艷?韓 丹 穆 欣

目的: 明確苦參堿對HaCaT細胞Bcl－2/Bax和Fas/FasL表達的影響。方法: 體外培養HaCaT細胞，選擇第二代細胞對數生長期HaCaT細胞作為研究對象，將細胞隨機分為4組:苦參堿2 mg/mL、10 mg/mL和50 mg/mL 3組及對照組(加入相同體積的0.9%鹽水)，孵育48 h后，MTT法測定各濃度下細胞增殖，RT－PCR檢測Bcl－2/Bax和Fas/FasL的表達。結果: 與對照組相比，當苦參堿濃度為2 mg/m L時，HaCaT細胞增殖活性無明顯變化；Bcl－2、Bax、Fas、FasL表達也無明顯變化(P＞0.05)。當苦參堿濃度為10mg/mL時HaCaT細胞增殖活性較對照組明顯下降(P＜0.001)；Bcl－2表達明顯下降，Bax表達上升(P＜0.001)；Fas、FasL表達上升(P＜0.05)。當苦參堿濃度為50mg/mL時，MTT法檢測HaCaT細胞增殖明顯抑制(P＜0.001)；同時Bcl－2、Bax、Fas和FasL的變化與10mg/mL時相似(P＞0.05)。結論: 苦參堿能夠調控上皮細胞致炎因子的表達，抑制細胞的增殖。

苦參堿； HaCaT細胞； 實時定量PCR； Bcl－2/Bax； Fas/FasL

正常皮膚角質形成細胞增殖和凋亡速度是相同的，但在銀屑病中存在多種細胞凋亡相關基因的表達異常，最終造成銀屑病角質形成細胞增殖和凋亡的平衡失常，其中以Bcl－2/Bax及Fas/FasL較為重要。維A酸類藥物對銀屑病有效但無法控制銀屑病的復發，在以往的研究中，我們試將維A酸類藥物與苦參素(苦參堿)合并應用，取得良好效果，1且患者可以維持較長的緩解期，為了進一步證實苦參堿的有效性，我們正在嘗試在臨床上單用苦參堿來治療尋常型銀屑病，小樣本的實驗已經取得了滿意的療效，本實驗對其作用機制進行進一步研究。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和器材 人永生化角質形成細胞(HaCaT細胞)(第四軍醫大學皮膚實驗室饋贈)，并由本實驗室保存；1640培養基(GIBCO)；苦參堿注射液(正大天晴)；四甲基偶氮唑藍MTT(Sigma)；TRIzol法總RNA抽提試劑盒(Invitrogen，USA)；PCR引物(北京奧克公司)；SYBR?Premix Ex TaqTMII(TaKa-Ra，日本)；5－Target qPCR Kit(BIO－RAD，USA)；cDNA試劑盒(Fermentas，加拿大)；內參采用β－actin；鼠抗人角蛋白單克隆抗體(AE1/AE3)(Santa Cruz)。

1.2 HaCaT細胞培養 HaCaT細胞復溫，采用鼠抗人單克隆抗體鑒定證實。復溫后的HaCaT細胞用含10%胎牛血清的1640培養基(含100 U/m L青霉素，100 U/mL鏈霉素)于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養，當細胞80%融合時，用0.25%胰蛋白酶－0.05% EDTA 37℃5 min消化傳代，吸管輕輕吹打；在顯微鏡下觀察到細胞變圓回縮時用含10%胎牛血清的1640培養基終止消化，細胞重新懸浮；以1∶3進行傳代。

1.3 HaCaT細胞的傳代 當細胞生長至80%～90%時，進行傳代。吸出培養瓶內原有的培養基，用PBS輕輕沖洗2遍。加入預熱至37℃的0.25%胰酶－0.05%EDTA，搖勻后放置37℃孵育箱孵育5 min，并在倒置顯微鏡下觀察，當細胞形態由多角形回縮至卵圓形時，快速加入預熱至37℃的含有10%胎牛血清的1640培養液胰酶終止消化，反復吹打，使細胞脫落并散開。將細胞懸液轉移至離心管中，1000 r/min離心5min。棄去上清液，再次用預熱至37℃的含有10%胎牛血清的1640培養液重新懸浮細胞，并將這些細胞懸液分裝至3個新的培養瓶中，放置于5% CO2、37℃培養箱中培養。將增殖到80%～90%的細胞作為研究對象進行研究。

1.4 MTT測定細胞增殖活性 將上述細胞重新消化隨機分成實驗組和對照組分別接種于24孔培養板，每3孔為1組，每孔加入1×104個細胞，待細胞貼壁后實驗組以苦參堿2 mg/mL、10 mg/mL和50 mg/mL梯度濃度分別加入相應的培養孔中；對照組加入等量的0.9%氯化鈉注射液繼續培養48 h，然后每孔加入20μLMTT溶液(濃度為5 g/L、PBS稀釋)，37℃繼續孵育4 h終止培養，小心吸棄上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10min，選擇490 nm波長，采用酶聯免疫檢測儀測定各孔吸光值(A值)，結果以統計圖表記錄。

1.5 細胞收集 將上述1.3細胞重新消化隨機分成實驗組和對照組分別接種于24孔培養板，每3孔為1組，每孔加入1×104個細胞，待細胞貼壁后實驗組以苦參堿2 mg/m L、10 mg/mL和50 mg/mL濃度分別加入相應的培養孔中；對照組加入等量的0.9%氯化鈉注射液繼續培養48 h，將上述各組細胞分別消化離心，收取沉淀的細胞。

1.6 RT－PCR檢測Bcl－2、Bax、Fas、FasL 將以上收集的不同組別細胞分別用液氮在研缽中研磨成粉末；移入玻璃勻漿器加入1 m L TRIzol抽打勻漿；按照標準抽提步驟進行RNA抽提；取樣品1μg，逆轉錄為cDNA，根據基因庫序列設計Bcl－2、Bax、Fas、FasL引物(表1)，建立RT－PCR反應體系；反應條件為:94℃預變性3 min，95℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40個循環。應用SYBR Green I熒光染料技術進行實時定量PCR反應，以β－肌動蛋白為內參，計算機分析Ct值，用以評定各因子mRNA的表達水平。待測樣品相對值＝2－[△Ctβ－肌動蛋白－△C(t)待測樣品]。

表1 RT－PCR引物序列

1.7 統計學方法 采用SPSS 13.0和Prism科學繪圖軟件進行統計學分析，t檢驗進行實驗組與對照組的比較，P＜0.05表示有統計學差異。

2 結果

2.1 MTT法檢測細胞增殖情況 見圖1。當苦參堿濃度為2 mg/m L時，實驗組A值與對照組比較無明顯變化(P＞0.05)；當苦參堿濃度為10 mg/mL時，實驗組A值與對照組比較下降明顯(P＜0.001)；當苦參堿濃度為50 mg/mL時，實驗組A值與對照組比較具有顯著性差異(P＜0.001)，與10 mg/mL組無顯著差異(P＞0.05)。

圖1 MTT法檢測不同濃度下HaCaT細胞增殖情況

2.2 RT－PCR檢測結果 見圖2。實驗組與對照組相比，當苦參堿濃度為2 mg/m L時，HaCaT細胞表達Bcl－2、Bax、Fas及FasL與對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)；當苦參堿濃度為10 mg/m L時，Bcl－2表達明顯下降(P＜0.001)；Bax表達顯著升高(P＜0.001)；Fas表達升高(P＜0.05)；FasL表達升高(P＜0.01)。當苦參堿濃度為50mg/mL時Bcl－2、Bax、Fas及FasL變化同10 mg/m L組，但FasL變化更明顯(P＜0.001)，兩組濃度間比較無明顯差異(P＞0.05)。以上結果說明:苦參堿在低濃度時對Bcl－2、Bax、Fas及FasL表達無顯著影響。而當其濃度為10 mg/mL時上述細胞因子檢測水平均出現明顯變化，但這種變化并不隨濃度的增加而增加。

圖2 苦參堿各濃度下HaCaT細胞Bcl－2、Bax、Fas及FasL的表達

3 討論

銀屑病組織病理顯示角化過度，角化不全，真皮乳頭血管彎曲擴張，表皮角質層或顆粒層內可見Munro微膿瘍。臨床可以看到患者皮損區細胞大量脫落，細胞更新增速。有研究報道這種改變可能與某些基因異常表達有關。2Bcl－2/Bax，Fas/FasL的表達失衡可能通過增強HaCaT細胞活性、產生致炎因子和免疫功能紊亂進而造成銀屑病發生。3

苦參堿來自苦參，從中醫理論來講苦參味苦，性寒，歸心、肝、胃、大腸、膀胱經。銀屑病急性發作和進展期往往表現為血熱和血燥，苦參正是通過清熱涼血來治療銀屑病。近年來西醫認為苦參的藥理作用主要由苦參堿來完成。苦參堿能夠影響上皮細胞某些基因的表達，調控致炎因子的水平，還能發揮免疫抑制作用并表現出良好的抗腫瘤活性。4在本課題研究中，我們觀察到苦參堿可以抑制HaCaT細胞增殖，且對HaCaT細胞某些基因表達具有顯著影響，它可能通過上調Bax、Fas及FasL，下調Bcl－2發揮作用，也有研究發現苦參堿顯著影響免疫細胞及增殖旺盛的腫瘤細胞中上述基因的表達，甚至具有良好的抗病毒作用，對于急性感染相關的點滴狀銀屑病治療效果可能更好。5－7

1牟寬厚，馬慧群.阿維A聯合苦參素治療尋常型銀屑病的臨床療效觀察.中國皮膚性病學雜志，2010，24(3):292－294.

2 Batinac T，Zamolo G，Hadzisejdic I，et al.Expression of Bcl－2 fam ily proteins in psoriasis.Croatian Med J，2007，48(3):319－326.

3 Yan C，Mc Cormick T，Cooper K.Activated interferon－gamma＋T cell caspase induction and decreased Bcl－2/Bax ratio may confer increased susceptibility to anti－Fas and ultraviolet B treatment.J Invest Dermatol，2005，124(4):129.

4何雄，韋星船，田裕昌，等.苦參堿及其衍生物合成及生物活性研究進展.中國現代應用藥學，2011，28(9):816－823.

5劉占術，陳建斌，湯為學，等.苦參堿對Raji細胞凋亡及凋亡相關蛋白Fas/FasL表達的影響.第四軍醫大學學報，2009，30 (22):2561－2564.

6 Yang Y，Xiu J，Zhang X，et al.Antiviral effect of matrine against human enterovirus 71.Molecules，2012，17(9):10370－10376.

7 Shin MS，Kim SJ，Kim SH，et al.New onset guttate psoriasis following pandemic H1N1 Influenza vaccination.Ann Dermatol，2013，25(4):489－492.

(收稿:2013－11－20 修回:2014－02－14)

Regulation of Bcl－2/Bax and Fas/FasL by matrine in HaCaT cells

MOU Kuan-hou，ZHOU Yan，HAN Dan，et al.Department ofDermatology，First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University，Xian，710061

Objective:To determine the effect ofmatrine on Bcl－2/Bax and Fas/FasL in keratinocytes in vitro.Methods:Second generation cultured HaCaT cells(logarithmic phase cells)were selected and divided into 4 groups:3 matrine groups(2mg/m L，10mg/m L and 50mg/mL were used in each group)and the control group(0.9%Natrii Chloride).After 48－hour culture，the proliferation of HaCaT were detected by MTT and the levels of Bcl－2/Bax and Fas/FasLweremeasured by RT－PCR.Results:The viability of HaCaT cells was similar in 2mg/mLmatrine group and control group(P＞0.05).In 10mg/mLmatrinegroup the proliferation of the cellswas significantly decreased(P＜0.001)and the Bcl－2 expression was remarkably reduced(P＜0.001)，while the expression of Bax，Fas and FasL was significantly increased(P＜0.01 and P＜0.05，respectively).When the concentration ofmatrine was increased to 50mL，the viability and the expression of Bcl－2，Bax，Fasand FasLwas sim ilar to the resultswhen 10mLmatrine was used.Conclusion:Matrine can inhibit HaCaT cells proliferation(at 10 mg/mL or more)and may adjust expression of Bcl－2/Bax and Fas/ FasL in HaCaT cells.

marine；HaCaT cells；Real－time quantitative PCR；Bcl－2/Bax；Fas/FasL

陜西省科技攻關項目(編號:2009k13－02)

西安交通大學第一附屬醫院皮膚性病科，710061

?通信作者