熱應(yīng)激預(yù)處理影響鼠背軸型皮瓣HSP70、HSF1表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

(株洲市中心醫(yī)院燒傷整形科,湖南株洲412008)

皮瓣移植容易發(fā)生缺血性壞死,而且一旦出現(xiàn),處理較為困難,容易引起醫(yī)患矛盾,眾多實(shí)驗(yàn)證實(shí),熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)對皮瓣有明顯的保護(hù)作用,減少皮瓣缺血缺氧造成的損害,減輕細(xì)胞損傷、保護(hù)細(xì)胞活性有很大作用。大鼠進(jìn)行預(yù)先熱應(yīng)激處理,缺血再灌注損傷明顯減輕[1],預(yù)先進(jìn)行熱休克處理對缺血皮瓣組織存活有改善作用。熱休克反應(yīng)(heat shock response,HSR)是機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)中的一種重要反應(yīng),熱休克蛋白(HSPs)是熱休克反應(yīng)表達(dá)的一組蛋白,保護(hù)細(xì)胞具有重要意義[1]。熱休克轉(zhuǎn)錄因子-1(HSF-1)通過調(diào)控影響熱休克蛋白表達(dá),HSF-1以單體形式存在于胞漿中,正常狀態(tài)下無活性,激活后轉(zhuǎn)變成二聚體,移位至胞核,啟動(dòng)熱休克元件(heat shock element,HSE)開始相應(yīng)表達(dá)[2]。熱休克預(yù)處理改善皮瓣存活率的機(jī)制鮮見詳細(xì)報(bào)道。本研究旨在通過活體鼠背缺血軸型皮瓣模型,觀測 HSP70、HSF1在皮瓣熱應(yīng)激處理后的動(dòng)態(tài)變化,探索減輕皮瓣缺血損傷的理論基礎(chǔ)及有效措施。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型及分組

雄性Sprague Dawley大鼠96只(SPF級),體重180～220 g,由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。稱重后,按編號隨機(jī)將動(dòng)物分為缺血組、實(shí)驗(yàn)組(HSP+缺血組)。皮瓣模型采用大鼠背部軸型皮瓣[3],每組48只大鼠分別阻斷蒂部后第1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 取標(biāo)本,規(guī)定以皮瓣邊緣中遠(yuǎn) 1/4處為標(biāo)本取材點(diǎn)。缺血組:皮瓣模型制備后,阻斷皮瓣蒂部第 1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 共 6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)(阻斷方法:使用血管夾帶橡皮套阻斷血管蒂,壓力以阻斷動(dòng)脈血運(yùn)為準(zhǔn)),每時(shí)間點(diǎn)8只,其中4只直接取標(biāo)本,4只觀測皮瓣存活情況;實(shí)驗(yàn)組(HSP+缺血組):先予以熱應(yīng)激處理,置于紅外線加熱燈下,使其肛溫升至42℃并維持30 min(用715型針型半導(dǎo)體測溫計(jì)監(jiān)測),室溫下恢復(fù)24 h,24 h后制作皮瓣,之后與缺血組相同。

1.2 標(biāo)本采集

標(biāo)本采集點(diǎn)為皮瓣遠(yuǎn)端壞死近側(cè)成活處皮瓣全層組織,大鼠在達(dá)到要求后都采用心臟空氣注入栓塞法致死。標(biāo)本先置于液氮并保存于-80℃。隨后用含有20 mmol/L Hepes、20%甘油、0.2 mmol/L DL-巰基蘇糖醇的溶液勻漿、離心,用BioRad試劑盒定蛋白含量。樣品進(jìn)行Western blots。用HSP70與提取的HSP轉(zhuǎn)移膜反應(yīng),用抗鼠過氧化酶進(jìn)行檢測,密度儀檢測放射自顯影的印跡。

1.3 動(dòng)物模型制備

以1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注入麻醉,皮瓣的切取:大鼠背部軸型皮瓣作為皮瓣模型[3]范圍為:前界是肩胛骨下角水平線,后界是髂嵴水平線下1.5～2.3 cm,內(nèi)界是鼠背中線,外界為中線外2.5～3.5 cm,此皮瓣含有3個(gè)血管領(lǐng)域,以旋髂深動(dòng)脈為蒂包括肋間后動(dòng)脈和胸外側(cè)動(dòng)脈兩個(gè)相鄰的血管領(lǐng)域。皮瓣大小約5 cm ×2.5 cm。沿預(yù)定線切開皮膚、肉膜組織,然后剝離,遇到穿支則切斷,切忌損傷胸外側(cè)動(dòng)脈、旋髂深動(dòng)脈的穿支。將皮瓣縫合成皮管,以前后界為蒂,直接拉攏縫合皮瓣供區(qū)。

1.4 指標(biāo)檢測皮瓣存活率的測定

皮瓣存活7日后,存活面積(%)=(皮瓣面積-壞死面積)/皮瓣面積×100%,依皮瓣存活的百分率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。HSP70和HSF1的檢測:HSP70和HSF1單克隆抗體、Western blot檢測試劑盒(武漢博士德生物工程公司進(jìn)口分裝)等及圖像分析儀。采用Western印跡法測定缺血組及實(shí)驗(yàn)組皮瓣中HSP70和HSF1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包,對3組之間的皮膚成活面積及HSF1和 HSP70(光密度)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(t檢驗(yàn)),數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 皮瓣成活率

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),缺血組的大鼠背部軸型皮瓣隨著缺血時(shí)間的增加存活率均逐漸降低,較實(shí)驗(yàn)組(HSP+缺血組)明顯下降,差異有顯著性(P＜0.05,表1)。

表1 兩組大鼠皮瓣蒂部不同阻斷時(shí)間存活率比較(%)

2.2 HSP70和HSF1的檢測結(jié)果

缺血組及實(shí)驗(yàn)組HSP70和HSF1的表達(dá)通過Western blot檢測,檢測結(jié)果見圖1。實(shí)驗(yàn)組比缺血組表達(dá)增多,缺血組及實(shí)驗(yàn)組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的HSF1比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖1 各組HSF1和HSP70表達(dá)Western blot檢測結(jié)果

2.3 皮瓣存活率與HSF1和HSP70的關(guān)系

先將HSF1缺血組、HSF1實(shí)驗(yàn)組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上HSF1信號灰度值與缺血組、實(shí)驗(yàn)組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)上的成活率進(jìn)行相關(guān)性分析,再將HSP70缺血組、HSP70實(shí)驗(yàn)組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上HSP70信號灰度值與缺血組、實(shí)驗(yàn)組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)上的成活率進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)皮瓣中HSP70和HSF1的表達(dá)與皮瓣存活率呈正相關(guān)(y=3.374 5+0.354 ln x,r=0.754 7,P＜0.01)。見表2。

表2 缺血組與實(shí)驗(yàn)組HSF1和HSP70表達(dá)的信號灰度值

3 討 論

HSR是普遍存在生物機(jī)體中,其報(bào)告一系列蛋白,如最小的熱休克蛋白泛素、HSP27、HSP60、HSP70、HSP90等等。Locke等[4]發(fā)現(xiàn)機(jī)體中HSP70量最多,存在于各種細(xì)胞中,當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激反應(yīng)或高溫時(shí),這種反應(yīng)能夠改變生物體的基因表達(dá),基因表達(dá)的改變直接誘導(dǎo)熱休克蛋白(HSPs)表達(dá),在這個(gè)過程中,熱休克蛋白轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factors,HSFs)直接參與熱休克蛋白表達(dá)的調(diào)控。這一族熱休克轉(zhuǎn)錄因子家族成員很多,而在參與熱休克反應(yīng)調(diào)控中,起主要作用的是HSF1。機(jī)體在應(yīng)激等情況下,HSF1激活HSPs,從而啟動(dòng)熱休克基因的轉(zhuǎn)錄,其產(chǎn)物HSPs表達(dá)增加。Black等[5]認(rèn)為,當(dāng)機(jī)體在應(yīng)急情況下,HSP70合成會(huì)增多,維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,保護(hù)細(xì)胞不受傷害,而且HSP70有明顯的抗凋亡作用,阻斷相關(guān)應(yīng)急激酶的激活,減少一氧化氮的合成[6]。李新枝等[7]在研究丙戊酸對大鼠急性脊髓損傷的保護(hù)作用時(shí)發(fā)現(xiàn)丙戊酸通過減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)HSP70表達(dá),對脊髓損傷起到保護(hù)作用,證明了HSP70對神經(jīng)的保護(hù)作用。一般情況下,HSF1以無活性單體形式存在胞漿中,當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí),細(xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化,HSF1單體通過其羧基端的三聚體相互結(jié)合形成三聚體結(jié)構(gòu),使HSF1單體向三聚體轉(zhuǎn)化。HSF1三聚體形成后,迅速移入核內(nèi),并通過氨基端的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain,DBD)與下游基因啟動(dòng)子區(qū)的熱休克元件(heat shock element,HSE)相結(jié)合,調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄[8]。HSF1除了能夠誘導(dǎo)HSPs的活化外,還能夠調(diào)控一些非熱休克基因的表達(dá),如一些炎癥因子。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組皮瓣中HSP70和HSF1的表達(dá)比缺血組增多,而且實(shí)驗(yàn)組皮瓣成活率明顯提高,Western blot結(jié)果顯示,在動(dòng)物熱休克蛋白的表達(dá)中,熱預(yù)處理組明顯高于單純?nèi)毖M,提示熱休克蛋白的產(chǎn)生與預(yù)熱能誘導(dǎo)有明顯的關(guān)系。預(yù)熱能誘導(dǎo)熱休克蛋白產(chǎn)生,對移植的皮瓣具有保護(hù)作用。在實(shí)驗(yàn)過程中,通過觀察不同時(shí)間點(diǎn)對HSP表達(dá)的影響,在設(shè)計(jì)1、2、4、6、8、10 h 缺血時(shí)間,結(jié)果表明動(dòng)物熱休克反應(yīng)4 h之內(nèi)預(yù)熱產(chǎn)生效果最好,這對臨床都有一定的價(jià)值。

采用大鼠鼠背軸型皮瓣為動(dòng)物模型,形成蒂部位于腹側(cè)的超長軸型皮瓣,發(fā)現(xiàn)在通過熱應(yīng)激預(yù)處理的皮瓣組織細(xì)胞中有大量的HSP70合成,由此推斷熱休克反應(yīng)產(chǎn)生HSP70在保護(hù)皮瓣中有很重要的作用。本實(shí)驗(yàn)采用Western印跡法對其機(jī)制進(jìn)行了初步的探討。大鼠鼠背軸型 皮瓣組織細(xì)胞在熱應(yīng)激預(yù)處理后,各時(shí)間點(diǎn)HSF1均較未經(jīng)熱應(yīng)激預(yù)處理的單純?nèi)毖M升高。在IPC后4～6 h時(shí)間點(diǎn),HSP70量的變化與HSF1的變化是大致平行的,所以推測熱休克反應(yīng)對皮瓣組織細(xì)胞的保護(hù)作用可能是:HSF1活化;HSP70轉(zhuǎn)錄、翻譯程度的增強(qiáng);HSP70具有分子伴侶作用,能穩(wěn)定細(xì)胞膜;保護(hù)細(xì)胞蛋白質(zhì),促進(jìn)糖轉(zhuǎn)運(yùn),貯備等作用,而且在清除異常蛋白促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)中,HSP70也具有很重要的作用。熱應(yīng)激預(yù)處理通過激發(fā)和扶持機(jī)體內(nèi)源性的抗損傷能力,從而保護(hù)組織、細(xì)胞,促進(jìn)其修復(fù),所以在臨床應(yīng)用中有較為重要的價(jià)值。HSP70及HSF1作為一種生物機(jī)體受刺激時(shí)產(chǎn)生的,具有保護(hù)細(xì)胞功能的蛋白質(zhì),應(yīng)該為熱應(yīng)激預(yù)處理保護(hù)機(jī)制的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中對HSF1和HSP70在皮瓣保護(hù)的作用進(jìn)行初步的探討,推斷HSP70、HSF1在皮瓣的延遲保護(hù)作用中扮演重要的角色,為今后的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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