RNAi技術在抗甲型流感病毒中的研究進展

韓慶功 鄭玉姝

（河南科技學院動物科學學院，新鄉 453003）

RNAi技術在抗甲型流感病毒中的研究進展

韓慶功 鄭玉姝

（河南科技學院動物科學學院，新鄉 453003）

RNAi技術廣泛應用于防治人類多種疾病病原的藥物和疫苗開發中，并取得了巨大的成果。流感病毒極易發生抗原漂移和抗原轉變，這給抗流感病毒藥物和疫苗的研制提出很大的挑戰。RNAi技術的出現給流感的防治提供了新的思路。對近年來國內外利用RNAi技術開發抗流感病毒藥物和新型流感疫苗研究現狀及前景進行綜述，以期為流感的綜合防治研究提供參考。

流感病毒 RNA干擾 siRNA miRNA 復制 疫苗

甲型流感病毒是正黏病毒科有囊膜的單股負鏈RNA病毒，其基因組有8個RNA片段，分別編碼病毒復制循環中必需的結構蛋白及非結構蛋白。根據病毒表面糖蛋白的不同，甲型流感病毒可以分為16種HA亞型（H1-H16）以及9種NA亞型（N1-N9），可感染多種宿主，包括禽、豬和人等［1］。從1878年流感發現于意大利至今，全球性的流感大流行已出現多次，給公共衛生安全造成極大的威脅；1918年暴發的西班牙流感（H1N1），造成近4 000萬人死亡；1957年的亞洲流感（H2N2）和1968年的香港流感（H3N2），均造成了近百萬人死亡；2003年12月，高致病性H5N1禽流感橫掃亞洲多國家禽養殖業，造成極大的經濟損失；2009年暴發的豬流感（H1N1），共在208個國家得到確診，累計1.8萬人死亡；2013年3月31日中國報道了全球第1例人感染H7N9病例，這是全球首次發現的由新亞型流感病毒引起人的一種急性呼吸道傳染病，新型禽流感病毒再次引起人們的關注。截至2014年2月4日共報告286例人感染H7N9禽流感病例，其中60例死亡。張寶等通過序列分析揭示新型H7N9病毒的來源和重組產生模式，推測出此次H7N9病毒流行至少由5個病毒經過4次重組產生，產生兩個主要流行株A和B型［2-4］。21世紀以來流感病毒流行爆發的這些新特點引起了世界各國的高度重視，也給流感病毒科研工作者提出了更嚴峻的挑戰。

目前流感病毒防治主要依靠藥物及疫苗，藥物主要包括離子通道M2阻滯劑和神經氨酸酶抑制劑等化學藥，但抗流感病毒藥物的長期應用可能產生

耐藥性病毒株。而流感疫苗不僅開發周期長，而且不能保護所有亞型的流感病毒感染，在一定程度上也限制了抗流感病毒爆發的效果。RNAi技術的出現為抗病毒研究提供了新思路，為病毒病的治療提供了一種新的選擇。近年來利用RNAi技術研究如何抗流感病毒成為熱點。

1 RNA干擾機制

RNAi（RNA interference，RNAi）是高度特異的在mRNA水平上的基因沉默機制，由內源性或外源性dsRNA（Double-stranded RNA，dsRNA）誘發。dsRNA 在細胞內被切割成21-25 nt干擾性小RNA（Small interfering RNA，siRNA），siRNA介導識別并靶向切割同源性靶mRNA分子，從而導致該基因不表達。MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中發現的一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA，其大小長約20-25個核苷酸。成熟的miRNAs是由較長的初級轉錄物經過一系列核酸酶的剪切加工而產生的，隨后組裝進RNA誘導的沉默復合體，通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據互補程度的不同指導沉默復合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。由于RNAi能特異性地抑制基因表達，所以可用于流感病毒感染的治療及預防［5］（圖1）。

圖1 RNAi途徑［5］

2 RNAi抗A型流感病毒感染的策略

2.1 siRNA靶向病毒mRNA抗流感病毒感染

因為RNA病毒基因組都比較小，RNA病毒基因幾乎都在病毒復制過程中發揮重要作用，理論上沉默病毒中的任何一個基因都可以抑制病毒的繁殖。流感病毒為分節段RNA病毒，其基因組存在高突變和基因重排的特征并因此產生多達15種HA和9種NA亞型，而且每種亞型還擁有眾多的病毒株，這給病毒的防治帶來巨大的挑戰。鑒于上述情況抗流感病毒siRNA的設計一般基于以下幾點考慮：（1）由于基因組RNA為NP蛋白所包被，因此siRNA優選靶向病毒mRNA而非基因組RNA；（2）為減少基因漂移和基因重排的影響，siRNA靶向mRNA高度保守區，這樣可以同時抑制不同亞型的病毒復制［6］。目前科研人員已經能夠設計出靶向流感病毒多個病毒株或多個基因的廣譜siRNA藥物［7-9］。例如，Sirnaomics公司開發的STP702即同時對H5N1、 H1N1及H3N2型流感病毒有效，雖然該藥物仍然沒有進入市場獲得檢驗，但其思路值得肯定。

2.2 靶向病毒svRNA抗流感病毒感染

甲型流感病毒包含8個單體RNA片段，每個片段都有兩個任務：通過轉錄過程制造蛋白；通過復制過程制造出新的病毒片段。因為每個單體必須執行兩個功能，病毒必須讓某一個過程優先完成，先轉錄然后再開始復制。 最近，西奈山醫學院微生物學家 tenOever BR 使用超高通量測序技術首次找到了甲型流感病毒中的一種svRNA，并確定它就是控制病毒從轉錄過渡到復制的“開關”。在H1N1（Influenza A/PR/34）感染的肺上皮細胞中，90%以上的小RNAs是細胞miRNAs，約0.12%直接來源于流感病毒，而在這些直接來源于流感病毒的小RNA中約有30%為svRNAs（Virus-encoded short vRNAs），由病毒RNA編碼，長度為22-27 nt，這些svRNAs可能通過與病毒聚合酶的相互作用調控病毒的轉錄和復制［10，11］。Umbach等［12］采用同樣的方法分析這些病毒RNA編碼的svRNAs，也證明了他們的存在。雖然這些svRNA的作用機制和功能仍有待進一步研

究，但是其可能成為抗流感病毒的新靶標，或者本身就是抗流感病毒的候選藥物。值得一提的是在流感病毒中，svRNA始終如一地位于病毒RNA片段之間，并且在每種流感病毒中都出現。這個發現意味著或許人們可以通過抑制svRNA影響病毒的復制過程，并最終研制出一種廣譜流感病毒RNA藥物。

2.3 siRNA靶向細胞mRNA抗流感病毒感染

流感病毒自身只編碼11個蛋白，卻可以在禽類和哺乳動物眾多宿主內復制，這是由于其利用了宿主細胞的眾多功能。RNAi技術成為篩選宿主基因組中的病毒復制相關基因的有力工具，研究表明宿主細胞通路中大量蛋白參與流感病毒復制過程［13］。因此，另一種利用RNAi抗流感病毒的方法是下調宿主細胞功能基因，因為宿主基因的突變率非常低，所以用這種方法抗流感病毒可以減少耐藥病毒株的出現，而缺點是干擾正常的細胞通路可能帶來一些副作用［14］。近幾年隨著基因組高通量篩選siRNA技術的發展應用，科研人員篩選出一系列流感病毒感染相關基因及其通路［15-17］。這些研究表明諸多宿主細胞基因在流感病毒復制中發揮重要作用。例如，SON、CLK1、ATP6V0D1、COPG、eIF4A3、FGFR，GSK3-β及CAMK2B等。其中包括流感病毒生長的一些基本元件，如nuclear export factors NXF1 和XPO1。靶向這些基因的siRNA在體內試驗中均表現出抗病毒特性。因此，利用siRNA下調宿主基因不失為一種抗流感病毒新的候選策略。

2.4 靶向細胞miRNA抗流感病毒

MicroRNA（miRNA）是一類調控基因轉錄和翻譯的小型非編碼RNA。作為轉錄后基因調控因子，miRNA在各種不同的基本生理活動和疾病中發揮作用。2010年，研究發現，miRNA作為關鍵的效應分子在宿主與病原相互作用中發揮重要功能。細胞miRNA不僅對病毒的復制具有正負調控作用，而且能夠通過改變細胞基因表達建立起抗病毒免疫防御反應［18］。顯然，研究與流行病和致命性流感病毒有關的特定的microRNA將有助于開發新的抗病毒治療方法，減少出現病毒耐藥的風險。

2.4.1 miRNA調控免疫反應 在動物和其他脊椎動物中，宿主編碼的miRNA參與調節了內在的和適應性的免疫應答。美國西北大學的研究團隊利用miRNA表達譜芯片分析表明一些內源性的miRNA在兩種甲型流感病毒侵染后出現明顯的積聚，這些miRNA包括miR-7、miR-132、miR-146a、miR-187、miR-200c和miR-1275［19］。研究表明甲型流感病毒侵染后是通過一個次級應答通路啟動初始體miRNA轉錄。基因表達譜分析發現這些miRNA靶向的26個基因（mRNA），包括IRAK1，MAPK3和其他先天免疫信號系統的組成成員。Lam等［20］的研究也表明禽流感病毒擾亂了宿主miRNA表達，病毒感染 后 miR-21*、miR-100*、miR-141、miR-574-3p、miR-1274a和miR1274b表達改變。其中高表達miR-141能抑制細胞因子-轉化生長因子（TGF-β2D）表達，而TGF-β2能夠吸引和調控炎癥因子，這種改變決定了感染的嚴重性。國內吉林大學研究團隊也發現流感病毒侵染細胞中，miRNA和Bcl-2家族抗凋亡因子蛋白之間存在相互聯系。分析發現一些和細胞凋亡有關的miRNA在甲型流感病毒侵染的A549細胞中被激發，其中miR-29c有明顯上調并介導了BCL2L2表達抑制和引起細胞凋亡［21］。上述研究都表明任何miRNA都具有潛在的抗病毒作用，從而成為機體防御病毒感染的關鍵一環。

2.4.2 miRNA影響病毒復制 流感病毒復制依賴宿主基因表達，因此通過miRNA調控宿主基因也會影響病毒的復制能力。Ma等［22］發現宿主microRNA let-7c能抑制人肺表皮細胞感染H1N1病毒的M1蛋白表達，從而抑制病毒復制。Song等［23］也發現miRNA 323（（miR-323），miR-491和miR-654靶向PB1基因的同一保守區并抑制H1N1流感病毒的復制。Song等［24］研究感染H1N1流感病毒患者的外周血單核細胞的miRNA變化后發現有多達41種miRNA發現變化。其中miR-31、miR-29a、miR-148a變化顯著，并直接影響細胞內多個重要通路和關鍵基因。此外，Wang等［25］綜合分析禽流感病毒感染的雞肺部miRNA及其靶基因的變化發現，ggamiR-34a、122-1、122-2、146a、155、206、1719、1594、1599和451發生了顯著變化。哥倫比亞大學研究者分析了調控豬流感H1N1病毒大流行和高致病性禽流感H7N7的兩類不同microRNA發現，有一小類microRNA同時調節這兩種病毒感染，靶向

這些miRNA可能開發出潛在的廣譜抗流感病毒藥物［26］。因此這些miRNA成為潛在的抗病毒治療靶標。

3 RNAi在流感疫苗開發和生產中應用

3.1 利用miRNA技術提高流感病毒疫苗生產能力

利用傳代細胞MDCK和vero細胞生產流感疫苗在近年得到快速發展，但野生型流感病毒和雞胚疫苗毒株在這些細胞中不能有效繁殖影響了流感疫苗的生產能力，也極大地限制了針對流感病毒的防治。因此，開發新型疫苗毒株和基于細胞生產流感病毒疫苗需提高病毒的生長滴度。RNAi技術為人們提高疫苗的生產能力提供了一條新的可行性途徑。

2011 年，RNAi先驅Alnylam制藥公司就與葛蘭素史克（GSK）公司合作，他們利用RNA干擾（RNAi）技術構建的重組疫苗株同時具有定向沉默某些特意基因的作用，從而抑制或提高流感病毒的繁殖與復制能力。將該重組疫苗株應用于細胞培養技術生產流感疫苗時，可實現增加疫苗生產過程中病毒滴度，從而提高疫苗生產能力［27］。最近日本的科研人員也在此方面取得了令人興奮的進展，通過篩選與I型干擾素途徑密切相關的78個靶基因并設計其shRNA序列，采用RNAi技術敲除相關基因后發現有23個候選基因敲除后能增強流感病毒A/Puerto Rico/8/1934在A549細胞中的繁殖能力。二次篩選后發現，敲除IRF7后能顯著抑制IFN-a/b產生，MDCK細胞中病毒滴度顯著增加。因此他們認為用RNAi技術敲除IRF7基因后能使疫苗的生產能力得到提高。值得一提的是，該技術還將有益于從臨床標本中更容易的分離出疫苗病毒株［28］。

3.2 應用microRNA 靶向性調控能力開發減毒疫苗

MicroRNA轉錄后小分子調節物還可以用于調節病毒載體的靶向性。因為miRNA主要通過5'端的前2-8 個核苷酸的種子序列（Seed sequence）識別mRNA 3'端非翻譯區（3'UTR）來實現在轉錄后水平上調節基因的表達，所以將含有特定microRNA靶向元件（miRNA target element，miRTE）的靶盒置于目的基因或病毒載體關鍵元件的3'UTR 區，就能通過內源性的microRNA 來調控目的基因的表達，達到在轉錄后水平上調節病毒載體的靶向性［29-31］。最近幾年，流感活體疫苗因能激活免疫系統的全部元件，成為競相開發的熱點。利用microRNA靶向元件消除病毒副作用為開發具有組織特異性的活體減毒疫苗提供了一條新途徑。如果在病毒基因組中插入宿主miRNA的靶序列，在病毒感染宿主細胞的復制增殖過程中，miRNA與病毒RNA 上的靶序列結合，抑制病毒RNA 的翻譯和病毒的增殖，從而導致減毒，這就是miRNA 介導的病毒減毒策略。由于其基于機體中固有的miRNA 與人工插入病毒基因組的靶序列互補而介導的翻譯抑制，所以此途徑適用于各種亞型流感病毒減毒株的構建。miR-93 是哺乳動物機體內普遍存在的一種miRNA，在人和鼠成纖維細胞中的表達是保守的。基于這一特征，Perez等［32］通過點突變的方法在流感病毒核衣殼蛋白保守區引入miR-93 靶序列，分別獲得H1N1 和H5N1 亞型流感病毒減毒株。這些減毒株即使高滴度接種小鼠，仍不能使小鼠致病。同時，減毒株免疫原性良好，接種小鼠后可誘導高水平的體液免疫應答，對野毒株的攻擊產生完全的免疫保護。更重要的是，由于miR-93 在雞胚中含量極低，減毒株在雞胚中的增殖不受抑制，其生長特性與野毒株相同，因此仍能采用雞胚培養的方式大量制備。這種方法還可以與現有的冷適應流感病毒活疫苗合并使用以進一步增強減毒性疫苗的安性性，減少從實驗室逃逸出高傳染性流感病毒的幾率。

3.3 利用miRNA技術提高流感病毒疫苗效價

人類基因組中有超過30%的基因受miRNA所調控，包括一些重要的免疫相關基因。因此人工利用這些miRNA的RNA干擾效應進行抗病毒是重要的研究領域，而如何在體內有效傳輸這些RNA小分子到特定細胞群體中是目前的科研瓶頸。澳大利亞的研究人員發現細胞因子信號轉導抑制因子（SOCS）作為重要的細胞因子調控子在主動免疫中發揮重要的作用，而miR-155在體內直接靶向SOCS而促進不同的T細胞亞群增值，因此他們利用反向遺傳工程使重組流感病毒表達miR-155并侵染細胞調控機體免疫機能，該研究為開發更強免疫效價的流感疫苗奠定了基礎。Perez團隊也成功將has-miR-142發夾結構插入流感病毒NS基因，重組病毒不僅保持復制能力還能在感染細胞中表達功能性has-miR-142。

流感病毒是RNA病毒，其感染局限于呼吸道，基因整合進宿主的風險也比DNA病毒載體低。鑒于流感病毒減毒疫苗已在臨床上證明是安全可靠，Perez認為用流感減毒株來作為載體遞送RNA藥物治療呼吸系統疾病不僅高效而且低毒［33］。

4 RNAi技術抗流感病毒的優點及存在挑戰

siRNA治療比常規化學藥（如Tamiflu和Relenza）具有某些優勢［34］。首先，siRNA藥物可以快速合成和規?；苽?；其次，當病毒對特定siRNA產生抗性時，可以立即更換靶向病毒的siRNA序列；第三，即便siRNA藥物的序列不同，但是其合成方法和工藝完全相同；第四，許多抗流感病毒藥物活性有機成分水溶性差，而siRNA極易溶于水，易于藥物輸送［35］。然而，抗流感病毒siRNA在臨床上也面臨挑戰，其中首要問題即如何有效傳輸RNA藥物至呼吸道。近年來國內外學者利用脂質體傳輸siRNA治療流感病毒取得了一些成果，但是這些方法仍存在一定的缺點，不能有效傳輸到呼吸道表皮細胞［36］。因此國內外學者在脂質體之外又開發出了多種不同的siRNA傳輸方法。慢病毒介導的RNAi具有轉移基因效率高，作用持久穩定等特點，成為基因治療和基因功能研究的重要工具。田進等［37］利用慢病毒表達靶向禽流感病毒PA、NP和PB2多個基因，成功抑制了病毒的復制。劉文博等［38］利用減毒鼠傷寒沙門氏菌表達禽流感病毒特異性siRNA，體內試驗表明其可以產生功能性siRNA，并對機體形成一定的保護力。

5 結語

甲型流感病毒感染是動物病毒性傳染病，不僅給養殖畜牧業造成巨大的經濟損失，而且嚴重威脅人類公共衛生安全。雖然目前已開發多種疫苗和抗病毒藥物，對流感病毒的防治起到很大促進作用；但是流感病毒變異極快，如何有效控制疾病仍然是擺在流感病毒科研工作人員面前的巨大挑戰，這促使人們不斷尋求新的防控途徑。RNAi的發現改變了人們對細胞基因調控的傳統思路，提供了特異性阻斷基因表達的新工具為抗流感病毒開辟了新領域。盡管其機制仍未完全弄清，但RNAi技術由于其特異性、穩定性、高效性、靶基因位點的高選擇性等突出優勢，為流感病毒等流行性疾病提供了新的治療方案。目前RNAi在各方面的研究日新月異，可以預見隨著RNAi技術的逐步應用，其將在人類防控或消滅甲型流感病毒過程中發揮巨大作用。

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（責任編輯 狄艷紅）

Research Advance of RNAi in Anti-influenza Virus

Han Qinggong Zheng Yushu
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003）

The RNAi technology has been widely used in drug and vaccine development of the prevention and treatment of various kinds of human diseases pathogeny,and has made great achievements.Antigenic drift and antigenic shift extremely easily occurred in influenza virus, which had put forward a bigchallenge for the development of anti-influenza virus drugs and vaccines.The appearance of RNAi technology gived good ideas for the prevention and control of influenza.This paper summarized the research status and prospects of using RNAi technology to develop anti-influenza virus drugs and new influenza vaccine at home and abroad in recent years, in order to provide

for the research for the prevention and control of influenza.

Influenza virus RNA interference siRNA miRNA Replication Vaccine

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.009

2014-04-09

河南省科技廳基礎與前沿技術（122300410135）

韓慶功，男，講師，碩士，研究方向：動物傳染病的診斷與防治；E-mail：hanqinggong7606@163.com