一種適用于RAPD分析的微量山茶DNA提取方法的建立

范晶李仲芳，2高明輝伏秦超

（1. 樂山師范學院生命科學學院，樂山 614004；2. 天水師范學院生命科學與化學學院，天水 741001）

一種適用于RAPD分析的微量山茶DNA提取方法的建立

范晶1李仲芳1，2高明輝1伏秦超1

（1. 樂山師范學院生命科學學院，樂山 614004；2. 天水師范學院生命科學與化學學院，天水 741001）

為建立一種滿足RAPD-PCR分析的簡便且高產率微量山茶基因組DNA提取方法，探索了在無液氮條件下，采用簡化試驗步驟的改良CTAB、SDS和Triton X-100方法分別提取山茶新鮮和干燥葉片DNA，通過光譜掃描和測定DNA在波長230 nm，260 nm和280 nm時的吸光度，比較不同DNA提取方法、材料保存方法以及材料用量對DNA提取效率的影響。結果表明，干燥葉片比新鮮葉片更適合作為DNA提取材料，改良CTAB法在提取干燥山茶DNA時純度和產率較理想，其A260/A280值為1.595-1.736，每克葉片可得到230-295 μg DNA，高質量DNA經RAPD-PCR擴增可獲得清晰擴增條帶。100 mg干燥山茶葉片適合獲得高純度和高產率的DNA，增加材料用量可增大DNA總量，但也增加了DNA中雜質含量。

DNA提取 RAPD 山茶 改良CTAB方法

山茶（Camellia japonica L.）屬于山茶科山茶屬常綠灌木，是原產于中國的珍貴花卉，在中國十大名花中排名第七，具有很高的景觀價值，廣泛應用于園林綠化、室內盆栽、立體景觀和插花藝術。我

國山茶主要集中在云南、四川、廣西和廣東等地，川茶花分布于四川盆地，品種繁多，占據了全國山茶20%的資源，在中國茶花中獨具一格［1］。樂山位于四川盆地西南部，介于北緯2828-2956，東

經10215'-10415'，是全國綠化模范城市、中國優秀旅游城市和國家園林城市。據文獻報道，樂山現發現63個山茶品種，其中包括珍貴的峨眉紅山茶、怒江紅山茶、金沙江紅山茶和杜鵑紅山茶等山茶原種資源［2］。關于樂山地區山茶的研究，目前主要集中在資源調查和利用同工酶酶譜進行分類學研究［3，4］。然而，樂山山茶遺傳多樣性方面還缺少系統研究。快速獲得高質量和高產率DNA是開展山茶群體遺傳結構和多樣性分析的重要前提，常規DNA提取方法通常包含液氮研磨樣品、反復離心抽提、乙醇沉淀和洗滌DNA等步驟，上述過程操作步驟較多，在進行大規模樣品的DNA提取時工作量較大，不能適應大批量樣品的快速檢測。山茶還富含多糖、多酚及其他次生代謝物質，這些物質可嚴重干擾所提取DNA的產率及質量［5］。本研究在參考已報道常規CTAB、SDS和Triton X-100 DNA提取方法基礎上［6-8］，通過簡化試驗步驟和替換部分實驗試劑，探索了改良的DNA提取方法，同時通過比較不同DNA提取方法、不同材料保存方法和不同材料用量對DNA提取效果的影響，最終建立了一種簡便、高產率的微量山茶DNA提取改良方法，為后續開展樂山地區山茶群體遺傳多樣性研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試山茶材料有七心紅山茶、浙江紅山茶、四季紅山茶、梔子茶、復色驕傲、復色三月茶、三月茶和窄葉西南。PCR buffer、MgCl2、Taq DNA聚合酶、dNTPs等RAPD-PCR反應試劑購自Takaka公司，隨機擴增引物序列為5'-TGATCCCTGG- 3'，由上海英俊公司（Invitrogen）合成，其他化學試劑為國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 DNA提取方法參考已發表文獻［6-8］，并對操作步驟進行了優化，主要體現在免去常規DNA提取時使用液氮、采用更常規和經濟的石英砂進行樣品研磨；減少氯仿/異戊醇等試劑抽提和離心取上清次數；減少材料用量以便降低DNA中雜質含量；為減少所獲得微量DNA的損失，在異丙醇沉淀DNA后，采用無水乙醇代替75%乙醇洗滌DNA 1次。

改良CTAB法參考已發表文獻并加以改良［6］。取石英砂磨碎后的100 mg山茶葉片，放入1.5 mL Eppendorf管中，加入750 μL 65℃預熱的2% CTAB提取液和15 μL β-巰基乙醇，輕輕上下顛倒混勻后放置65℃水浴鍋中保溫50 min，期間每隔10 min左右搖勻1次。從水浴鍋中取出離心管，加入450 μL氯仿∶異戊醇（24∶1）進行抽提，搖勻后12 000 r/min離心10 min，轉移500 μL上清液至一個干凈離心管中，加入10%體積的3 mol/L醋酸鈉溶液和等體積的預冷異丙醇，混勻后于-20℃放置2 h沉淀DNA。12 000 r/min離心10 min棄上清，所獲得DNA沉淀用500 μL無水乙醇洗滌一次，12 000 r/min離心5 min后去除無水乙醇，于空氣晾干DNA沉淀，溶解于50 μL無菌水并保存于-20℃備用。

改良SDS法參照分子生物學實驗指導并加以改良［7］。取100 mg石英砂磨碎的山茶粉末葉片裝入1.5 mL Eppendorf中，加入750 μL經65℃預熱的SDS細胞DNA提取液，上下顛倒輕輕混勻，65℃水浴50 min，期間每10 min左右將離心管搖勻1次，將離心管從水浴鍋中取出并加入235 μL的5 mol/L KCL溶液，冰浴20 min后12 000 r/min離心5 min，將750 μL上清液轉入新的1.5 mL離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇（24∶1）進行DNA抽提，12 000 r/min離心10 min后取上清并轉移至新的離心管中，加等體積預冷異丙醇，-20℃放置2 h沉淀DNA，后續步驟同改良CTAB法。

改良Triton X-100法參照并改良了田杰的方法［8］。取石英砂研磨的山茶葉片粉末100 mg裝入1.5 mL Eppendorf管中，加入750 μL的Triton X-100 DNA提取液，輕輕混勻后放置65℃水浴50 min，每10 min左右搖勻1次，之后從水浴鍋中取出離心管，加入60%體積的氯仿/異戊醇（24∶1）混勻，12 000 r/min離心10 min取500 μL上清，加等體積異丙醇并混勻，-20℃放置2 h沉淀DNA，后續步驟同改良CTAB法。

1.2.2 DNA提取效果檢測 分別取10 μL改良CTAB、SDS和Triton-X100法提取的DNA，轉入比色皿中并用無菌水補至2 mL，使用UV1901紫外分光光度計測量230 nm、260 nm和280 nm波長時吸

光度判斷DNA的濃度及產率，根據A260nm/A280nm、A260nm/A230nm比值判斷所制備DNA的純度，參考吳波等文獻計算DNA的濃度和產率，DNA濃度（μg/mL）=稀釋倍數×OD260×50，DNA產率（μg/g）=DNA濃度（μg/mL）×體積（mL）/葉片重量（g）［9］。

1.2.3 RAPD-PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳 RAPDPCR擴增反應體系為20 μL，其中含1×PCR Buffer、200 μmol dNTP、2 mmol MgCl2、0.8 μmol上下游引物、lU Taq DNA聚合酶和1 μL DNA模板。PCR擴增條件為94℃預變性4 min；94℃變性1 min，37℃退火1 min，72℃延伸2 min，共45個循環；72℃延伸10 min。PCR擴增結束后，擴增產物用0.8%濃度的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

2 結果

2.1 提取方法對DNA提取效果的影響

為了確定適合微量山茶葉片DNA提取的方法，我們采用改良CTAB、SDS和Triton X-100方法分別提取100 mg七心紅山茶葉片DNA，通過紫外分光光度計進行DNA光譜掃描和測定230 nm、260 nm和280 nm波長時的吸光度。結果顯示3種方法中，改良Triton X-100方法的DNA產率最高，改良CTAB方法次之，改良SDS方法最低。但在DNA純度方面，A260/A280和A260/A230比值顯示改良CTAB方法＞改良Triton X-100方法＞改良SDS方法（表1），該結果和DNA光譜掃描結果一致（圖1）。改良的CTAB方法（圖1-a）和改良SDS方法（圖1-b）提取的DNA光譜掃描結果顯示兩者在波長260 nm時均有一個比較明顯的DNA吸收峰，說明均成功提取到DNA。但改良SDS方法提取的DNA在230 nm和280 nm波長時還分別有一個比較明顯的吸收峰，說明DNA中含有一定比例的鹽、糖和蛋白質等雜質（圖1-b）。而Triton X-100提取的DNA光譜掃描結果顯示掃描曲線偏離基線較嚴重，說明提取物中除了含有較高濃度的DNA外，還含有較高濃度的雜質（圖1-c），綜合來看，改良CTAB方法最適合作為微量山茶DNA的提取方法。

表1 不同方法對DNA提取效果的影響

2.2 材料保存方法對DNA提取效果的影響

為了探明山茶保存狀態對DNA提取的影響，本研究采用改良CTAB法分別提取200 mg新鮮葉片和干燥葉片的DNA。光譜掃描結果顯示干燥葉片（圖1-d）和新鮮葉片（圖1-e）提取物在260 nm處均有吸收峰，說明均能提取DNA，DNA吸光度結果表明干燥葉片DNA產率高于新鮮葉片，且干燥葉片A260/A280比值大于新鮮葉片對應比值（表1），表明干燥葉片更適合作為DNA提取材料。

2.3 材料用量對DNA提取效果的影響

為了探索山茶用量對提取DNA的影響，我們采用改良的CTAB方法分別提取了100和200 mg山茶干燥葉片DNA。結果顯示，增加材料的用量可以雖然可以增加提取DNA的總量（表1），但會導致DNA中雜質含量增多，光譜掃描結果圖1-a顯示100 mg山茶葉片提取的DNA在波長260 nm時有一個比較明顯的DNA吸收峰。圖1-d顯示200 mg山茶葉片提取產物在230 nm、260 nm和280 nm波長處各有一個比較明顯的DNA吸收峰，說明提取的DNA中含有較大含量的雜質，其純度低于100 mg葉片提取的DNA，因此，控制材料用量是獲得高純度DNA的關鍵。

2.4 RAPD-PCR擴增結果

為了驗證改良CTAB方法提取的DNA能否滿足分子標記遺傳學分析，我們提取了7個硅膠干燥且低溫保存時間長達131 d的山茶葉片基因組DNA，

采用一個隨機擴增引物對其進行RAPD-PCR擴增。圖2結果顯示，以7個山茶樣品的DNA為模板進行擴增，均能得到清晰的DNA條帶并顯示出基因多態性，說明本研究建立的改良CTAB法適用于山茶分子遺傳標記分析。

圖1 3種方法提取DNA的光譜掃描結果

圖2 7個山茶樣品的RAPD-PCR擴增結果

3 討論

分子標記技術現已廣泛應用于植物遺傳育種和系統進化研究，由于研究時需要涉及到較大數量樣品，因此，建立一種操作步驟簡單的適合較大群體遺傳分析的DNA提取方法受到廣大研究人員的重視［10］。目前，通過已有文獻報道的方法能夠提取出山茶DNA并進行遺傳標記分析［11，12］，但普遍存在使用液氮和操作步驟復雜等可改進之處，同時不同DNA提取方法還存在各自的優缺點和最佳應用范圍。劉嬋等［13］采用CTAB、改良CTAB、SDS、改良SDS 4種方法提取滇山茶基因組DNA，結果發現改良CTAB為最佳DNA提取方法，SDS法不能較好提取DNA，他們在運用改良CTAB方法提取DNA時，首先采用液氮磨碎樣品，然后用氯仿-異戊醇-乙醇溶液抽提上清2-3次，RNaseA消化去除RNA，最后采用99.5%的冷乙醇沉淀DNA，76%的乙醇洗滌DNA，操作步驟相對較為復雜。Yang等［14］采用改良SDS法提取大果油茶嫩葉基因組DNA，通過添加高濃度醋酸鉀溶液沉淀蛋白質-SDS復合物和RNA、70%乙醇洗滌DNA去除鹽等雜質以及RNA酶消化DNA中的RNA等步驟，獲得進行ISSR-PCR分析的DNA。本研究采用3種簡化試驗步驟的改良CTAB、SDS和Triton X-100方法提取DNA，結果顯示改良的CTAB、SDS和Triton-X100三種方法均能成功提取出微量山茶DNA，但以改良CTAB方法提取的DNA效果最佳（表1，圖1）。在本研究改良CTAB方法中，改進步驟主要表現為采用常用的石英砂代替液氮對材料進行研磨，減少氯仿/異戊醇

抽提和離心取上清次數，在進行DNA沉淀時，采用異丙醇代替乙醇進行DNA沉淀，主要是考慮了2個因素：第一，異丙醇沉淀DNA效率高于乙醇；第二，異丙醇沉淀可減少DNA受多糖和雜蛋白污染的程度。由于提取DNA時使用的是微量材料，為減少DNA的損失，我們還對2個實驗步驟進行了改進：第一，異丙醇沉淀DNA時加入10%體積的3M醋酸鈉溶液，其原理是用陽離子Na+可中和DNA分子上的負電荷，以便降低DNA分子之間的同種電荷排斥力，促進DNA發生聚合并形成沉淀。第二，我們采用無水乙醇代替75%乙醇洗滌DNA，一方面可以減少DNA再次溶解于水而導致進一步損失；另一面是考慮到沉淀DNA的異丙醇不容易揮發，而無水乙醇揮發更快，可促進DNA更快干燥。

高質量基因組DNA的獲得是進行山茶分子遺傳多樣性研究的關鍵步驟，由于山茶細胞內含有大量的多糖、酚類和色素等物質［15］。它們可干擾所獲得基因組DNA的質量，嚴重時可導致PCR擴增失敗，而通過減少材料用量來降低DNA中雜質含量是較好的選擇。試驗中我們以100和200 mg山茶葉片為材料進行DNA提取，結果顯示100和200 mg材料均能獲得較高DNA產率，每克葉片DNA可分別達到295 μg和230 μg。譚曉風等［16］采用改良CTAB法提取32個山茶DNA時，每克葉片DNA提取產率最高為110 μg。倪穗等［17］采用改良CTAB法提取紅山茶基因組DNA時，每克鮮組織可得到50 μg左右的總DNA。

野外采集材料往往存在一些客觀條件制約，表現尤為突出的是所采集的樣品不能及時帶回實驗室進行處理，因此試驗樣品的處理和保存對于成功開展后續分析具有重要的意義。林立等［18］在進行中日5個島嶼山茶種群遺傳多樣性研究時，采用冰袋對山茶嫩葉進行保鮮運輸。周阿濤等［19］在進行云南山茶序列多態性分析時，DNA提取時使用的樣品是常溫保存且變色硅膠干燥的山茶新鮮葉片。本研究中，同時比較了新鮮葉片和硅膠干燥葉片的DNA提取效果，發現硅膠干燥葉片提取DNA的產率和純度均優于新鮮葉片。駱文華等［20］在提取廣西火桐基因組DNA時也得到類似結果，他們發現保存時間90 d的硅膠干燥葉片的DNA產率高于新鮮葉片，但DNA純度相當。代文娟等［21］認為硅膠干燥保存時間在10 d至l0個月之間的植物葉樣最適合提取DNA，此階段樣品所得DNA得率高且純度較好。本研究應用改良CTAB方法提取了7個保存時間為131 d的硅膠干燥山茶樣品的基因組DNA，RAPDPCR結果顯示各個樣品提取的DNA能夠擴增出條帶并顯示出較好的遺傳多樣性。本研究為下一步開展樂山山茶群體遺傳結構研究奠定了基礎。

4 結論

采用光譜掃描和測定DNA吸光度比較改良CTAB、SDS和Triton X-100法提取山茶DNA的效率，結果表明本研究的建立的改良CTAB法適合作為山茶DNA的提取方法，DNA完整性較好，A260/A280值介于1.595-1.736，DNA產率較其他文獻報道方法有較大提高，每克葉片DNA含量可達230-295 μg。干燥葉片比新鮮葉片更適合作為DNA提取材料，在無液氮條件下，采用改良CTAB法提取100 mg山茶干燥葉片DNA，所得DNA的純度和產率均較為理想，且能夠滿足RAPD-PCR遺傳分析。本研究建立了一種簡便且高產率的微量山茶DNA提取方法，可簡化試驗處理過程、降低實驗成本、有效提高大批樣品的檢測效率。

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（責任編輯 狄艷紅）

Establishment of a DNA Extraction Method Suitable for RAPD Analysis of Trace Arnounts of Camellia japonica L.

Fan Jing1Li Zhongfang1，2Gao Minghui1Fu Qinchao1
（1. College of Life Science，Leshan Normal University，Leshan 614004；2. College of Life Science and Chemistry，Tianshui Normal University，Tianshui 741001）

To explore a simple and high yield method for preparing DNA suitable for RAPD analysis, trace fresh and dried leaves of Camellia japonica L. were used as materials. Moreover, the improved CTAB, SDS and Triton X-100 methods without using liquid nitrogen were compared. The efficiencies of different DNA extraction methods, the effects of material preservation and material amounts on DNA qualities were compared based on the absorbance spectrum and ratio of absorbance at 230 nm, 260 nm and 280 nm by Ultraviolet Spectrophotometry. Results showed that dried materials were more suitable for DNA extraction than fresh materials. The improved CTAB protocol for isolating DNA from dried leaf tissues gave satisfied results, with the ratio of A260/A280 ranged from 1.595 to 1.736. Furthermore, the DNA yield reached 230 to 295 μg per gram of leaf. Finally, clear amplified bands were detected by RAPD-PCR. High quality and high yield genomic DNA could be prepared from 100 mg dried leaves of Camellia japonica L., an increase in materials leads to the increased in DNA amount, however, impurity was also increased.

DNA extraction RAPD Camellia japonica L. Improved CTAB protocol

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.011

2014-06-174

樂山師范學院科研項目（Z1201），樂山師范學院峨眉山生物多樣性保護與利用研究所科研項目（12S01）

范晶，男，博士，副教授，研究方向：植物分子生物學；E-mail：fanjing972001@sohu.com