費氏鏈霉菌（Streptomyces fradiae）FIM-S38胞外產新霉素的發酵條件優化

周璟明 陳宏 張祝蘭 孫菲 張引 周劍 方東升

（福建省微生物研究所，福州 350007）

費氏鏈霉菌（Streptomyces fradiae）FIM-S38胞外產新霉素的發酵條件優化

周璟明 陳宏 張祝蘭 孫菲 張引 周劍 方東升

（福建省微生物研究所，福州 350007）

旨在對Streptomyces fradiae FIM-S38胞外產生的次級代謝產物新霉素進行發酵條件優化。采用單因素篩選結合正交試驗優化發酵培養基，探討搖瓶發酵的主要影響因子初始pH值、裝液量、轉速等發酵參數的影響，確定了適宜發酵培養基組成和較佳發酵參數：葡萄糖6.0%，可溶性淀粉3.5%，黃豆粉2.0%，硫酸鎂0.1%，碳酸鈣0.3%，初始pH7.0，裝液量50 mL/500 mL，搖床轉速250 r/min，發酵溫度35℃，發酵時間6 d，優化后的發酵水平較原生產工藝提高了50%以上。

費氏鏈霉菌 新霉素 正交設計法 發酵 優化

新霉素（Neomycin）系由費氏鏈霉菌（Streptomyces fradiae）［1］產生的氨基糖苷類抗生素［2，3］，是一種理想的干擾蛋白質合成的殺菌劑［4］，臨床上主要用于治療胃腸道和呼吸道感染，同時新霉素能提高飼料的利用率，促進禽畜生長，因此被廣泛地應用于畜牧業，生產綠色食品［5，6］，近年來市場對新霉素的需求急劇增長。一些研究發現，新霉素能通過阻遏成纖維生長因子和內皮生長因子來干擾血管的形成，可能發展成為抗癌藥物［7］，此外，還有研究發現新霉素具有巨大的抗HIV潛力［8］。目前國內新霉素生產中普遍存在發酵過程復雜、周期長，發酵水平波動性大，低產率高單耗等嚴重缺陷，優良新霉素菌種的發酵工藝優化已成為提高新霉素產量和質量的關鍵途徑。本課題組前期對新霉素生產菌種Streptomyces fradiae SF1109進行抗性篩選獲得一株新霉素的抗性基因突變高產菌Streptomyces fradiae FIM-S38，本研究擬對FIM-S38的發酵培養基組成及發酵參數進行優化，旨在為解決生產實際需要和提

高新霉素市場競爭力奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌 種 弗 氏 鏈 霉 菌Streptomyces fradiae FIM-S38，指示菌金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus CPCC160020，由福建省微生物研究所提供。

1.1.2 培養基

1.1.2.1 斜面培養基 參照馬林等［9］報道的斜面培養基。

1.1.2.2 對照發酵培養基 參照滕慧等［10］報道的發酵培養基。

1.2 方法

1.2.1 培養方法 根據試驗方案改變培養基組成及培養條件，采用劃線法將培養好的菌種接入裝有50 mL發酵培養基的500 mL三角瓶中，34℃、220 r/min培養168 h，測定發酵效價和菌體生長量。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 效價檢測 參照《中國藥典》2010 版抗生素微生物檢定法（附錄XI A），效價為3次平均值，以相對值標示。

1.2.2.2 菌體生長量測定 取10 mL發酵液于離心管中，3 500 r/min離心10 min，測得沉淀物在發酵液中的比例（Packed Mycelial Volume，PMV）即為菌絲濃度。

1.2.3 統計學分析 采用SPSS11.5軟件進行統計分析，數據以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 碳源的影響

以無碳源的對照發酵培養基，按3.0%的濃度分別添加糊精、可溶性淀粉、葡萄糖、甘油、麥芽糖等各種碳源發酵FIM-S38，以3.0%糊精為碳源的發酵培養基產新霉素的相對效價（Relative Titer，RT，%）為100，結果（表1）表明，碳源種類對新霉素產量的影響比對菌體生長大，FIM-S38菌濃度在13.5%-16.3%之間，可溶性淀粉和葡萄糖作為碳源時，產新霉素水平較高。因此選擇可溶性淀粉和葡萄糖作為復合碳源。

表1 碳源對Streptomyces fradiae FIM-S38生長及合成新霉素的影響

2.2 氮源的影響

用無氮源的對照培養基，按3.0%的濃度分別添加蛋白胨、麩質粉、酵母粉、黃豆粉及玉米槳粉等各種氮源發酵FIM-S38，以3.0%蛋白胨為氮源的發酵培養基產新霉素的相對效價為100。結果（表2）表明，氮源種類對新霉素產量和菌體生長均影響明顯，添加蛋白胨FIM-S38菌體PMV在13.5%，添加麩質粉、酵母粉、黃豆粉及玉米槳粉，FIM-S38菌體 PMV在21.6%-30.8%之間，其中黃豆粉作為氮源時，產新霉素水平最高。因此選用3.0%黃豆粉作為氮源。

表2 氮源對Streptomyces fradiae FIM-S38生長及合成新霉素的影響

2.3 無機鹽的影響

在以3.0%黃豆粉為氮源的對照培養基中分別加入少量的無機鹽進行單因子試驗，以不加無機鹽發酵產新霉素的RT為100，結果（表3）顯示，培養基中添加微量金屬離子對FIM-S38菌體生長影響較小，其PMV在20.0%-23.5%之間，鐵、鎂、鈉、鋅、鈣鹽對FIM-S38合成新霉素均具有促進作用，新霉素產量最高可達146.2。因此選擇硫酸鎂、碳酸鈣為培養基中的無機鹽。

2.4 培養基正交試驗

根據上述試驗結果，選擇葡萄糖、可溶性淀粉、黃豆粉、硫酸鎂和碳酸鈣作為發酵培養基組成。正

交設計考察培養基各成分對產新霉素的影響，按表4所列因素和水平選用L16（45）表安排試驗。結果（表5）顯示，以對照發酵產新霉素的相對效價為100，通過正交設計助手軟件分析，對產新霉素的影響主次順序為葡萄糖＞可溶性淀粉＞黃豆粉＞碳酸鈣＞硫酸鎂，確定最佳組合為葡萄糖6.0%，可溶性淀粉3.5%，黃豆粉2.0%，硫酸鎂0.1%，碳酸鈣0.3%。

表3 無機鹽對FIM-S38生長及合成新霉素的影響

表4 正交設計因素水平表

表5 正交試驗結果

2.5 培養基初始pH值的影響

將優化發酵培養基調整至不同pH值進行發酵。以初始pH7.0的培養基發酵產新霉素的效價為100，結果（圖1）表明，FIM-S38對酸堿性環境均有較強的適應能力，在初始pH3.0-11.0范圍內菌體生長良好，酸性條件更利于菌體的繁殖，而在初始pH6.0-8.0范圍內的發酵培養基最宜產新霉素，初始pH為7.0時新霉素產量最高。因此選擇培養基的初始pH為7.0。

圖1 初始pH值對FIM-S38生長及合成新霉素的影響

2.6 搖床轉速的影響

在優化培養基中考察FIM-S38在不同轉速下的發酵情況，以轉速250 r/min發酵產新霉素的效價為100。結果（表6）表明，搖床轉速在125-280 r/min之間時，隨著轉速的增加，其新霉素產量亦提高，因此考慮搖床實際情況250 r/min的轉速較合適。

表6 搖床轉速對FIM-S38合成新霉素的影響

2.7 培養基裝液量的影響

對FIM-S38進行優化培養基的不同裝液量發酵試驗，以500 mL三角瓶裝液量50 mL發酵產新霉素的效價為100。結果（表7）表明，發酵水平隨裝量的增多而降低，在一定的裝量范圍內通氣量與發酵水平呈正相關，說明該菌株對氧的需求較高，而發酵液裝量太少，蒸發量較大，發酵容積小，因此選擇50 mL/500 mL三角瓶為適宜裝液量。

表7 裝液量對FIM-S38合成新霉素的影響

2.8 發酵溫度的影響

在發酵培養過程中，菌體生長、代謝、產素的酶活性受許多因素影響，其中培養溫度是一個重要影響因素。微生物有其最適和最耐受的溫度范圍，同一種微生物在不同的生長階段和不同的生理、生化過程中，最適溫度往往也不一樣。由表8可知，在上述確定的發酵條件下，以35℃發酵產新霉素的效價為100，在28-35℃時產量與溫度呈正相關，溫度為35℃ 時發酵產量最高，溫度提高到37℃時產量反而減少。因此在搖瓶培養過程中，35℃為菌體代謝最宜溫度。

表8 發酵溫度對FIM-S38合成新霉素的影響

2.9 菌體生長及生物合成新霉素的時間進程

FIM-S38在上述確定的發酵條件下的發酵時間曲線（圖2）表明，在培養初期菌體大量生長而合成新霉素量少，在發酵48-72 h之后菌絲的生長發育即停止，但新霉素生物合成明顯增加，以120 h發酵產新霉素的效價為100，在144 h其效價達到最高峰，其發酵效價為136.4。

圖2 菌體生長及合成新霉素時間曲線

2.10 優化發酵條件的驗證

在原發酵條件和優化發酵條件下進行5批次的發酵驗證。以對照原發酵條件發酵產新霉素的RT為100，結果（表9）表明，優化組發酵液中的發酵水平較對照組提高了57%、菌體生長量降低了8%，因此進一步驗證了Streptomyces fradiae FIM-S38的優化發酵參數。

表9 驗證試驗的結果（n=5）

3 討論

改良微生物發酵參數，創造適合菌體生長和生物代謝的最佳條件，才能最大限度地發揮菌株的優良性能提高產物產量，因此探索菌株高產特性充分表達的最佳培養條件是發酵生產的基礎與關鍵。由于Streptomyces fradiae FIM-S38系胞外產新霉素，在相同發酵水平下，發酵結束時菌體濃度越低越有利于發酵液過濾和提取等后期處理，即菌體濃度低而發酵效價高的發酵條件是理想的選擇。因此采用正交設計法以發酵效價和菌體生長量為指標對新霉素的發酵培養基配方中各組分的含量進行優化，篩選獲得了適宜發酵培養基組成和較佳發酵參數，其菌體生長良好而菌濃度明顯減少，同時新霉素產量顯著提高。通過在綜合最優條件下的5批搖瓶發酵驗證試驗，證實優化發酵條件下FIM-S38的發酵水平明顯優于對照，其發酵液中新霉素產量顯著提高。

新霉素原發酵培養基組成成分多，培養液中存在大量不溶性顆粒，配制過程復雜，致使生產易染菌，成本高。在優化發酵培養基配方中，以單一氮源代替原生產工藝培養基中的多種氮源，配制簡便，同時添加少量的鎂、鈣鹽提高了菌體的代謝能力和目標產物的合成能力，通過條件優化發酵周期由原工藝的168 h 縮短到144 h，提高了產素率，若應用到幾十噸乃至上百噸生產發酵罐進行工業生產，將會大大降低生產成本，增加產量，具有較強的市場競爭力。通過對弗氏鏈霉菌Streptomyces fradiae FIM-S38發酵過程控制研究，發現該菌株對氧的需求量較大，在生產工藝方面還有進一步改進提高的潛力，如生長因子、表面活性劑及其添加時間對生物合成目標產物的影響等，均有待深入的研究。

4 結論

通過對Streptomyces fradiae FIM-S38胞外產生的次級代謝產物新霉素進行發酵條件研究，采用單因素篩選結合正交試驗優化發酵培養基組成，同時單因素試驗考察搖瓶發酵參數，如初始pH值、裝液量、轉速等主要影響因子的影響，確定了適宜發酵培養基組成和較佳發酵參數：葡萄糖6.0%，可溶性淀粉3.5%，黃豆粉2.0%，硫酸鎂0.1%，碳酸鈣0.3%，初始pH7.0，裝液量50 mL/500 mL，搖床轉速250 r/min，發酵溫度35℃，發酵時間6 d，優化后的發酵水平較原生產工藝提高了50%以上。

［1］Rinehart KL Jr, Stroshane RM. Biosynthesis of aminocyclitol antibiotics［J］. Journal of Antibiotics, 1976, 29（4）：319-353.

［2］Huang F, Spiteller D, Koorbanally NA, et al. Elaboration of neosamine rings in the biosynthesis of neomycin and butirosin［J］. Chembiochem, 2007, 8（3）：283-288.

［3］Waksman SA, Lechevalier HA. Neomin, a new antibiotic active streptomycin-resistant bacteria, including tuberculosis organisns［J］. Science, 1949, 109（3）：305-307.

［4］Mehta R, Champney WS. Neomycin and paromomycin inhibit 30S ribosomal subunit assemblyin Staphylococcus aureus［J］. Current Microbiology, 2003, 47（3）：237-243.

［5］沈川, 肖希龍.新霉素在動物體內的殘留及其測定方法［J］.中國獸醫雜志, 1998, 32（2）：253-256.

［6］管玉霞, 劉志瓊.一種提高新霉素產素率新方法的初步研究［J］.產業與科技論壇, 2007, 6（7）：89-90.

［7］滕慧, 張亞雄.新霉素研究進展［J］.三峽大學學報：自然科學版, 2008, 30（2）：95-98.

［8］顧覺奮, 陳麗萍.新霉素A、B及其衍生物抗HIV作用的研究［J］.國外醫藥抗生素分冊, 2008, 29（4）：154-159.

［9］馬林, 達娃, 劉運, 等.費氏鏈霉菌中子輻射誘變菌株對新霉素的生物轉化［J］.微生物學通報, 2010, 37（9）：1347-1355.

［10］滕慧, 張亞雄.復合誘變選育新霉素高產菌株的研究［J］.中國釀造, 2008, 13（7）：37-39.

（責任編輯 馬鑫）

Optimization of Fermentation Conditions for Neomycin-producing Strain Streptomyces fradiae FIM-S38

Zhou Jingming Chen Hong Zhang Zhulan Sun Fei Zhang Yin Zhou Jian Fang Dongsheng
（Fujian Institute of Microbiology，Fuzhou 350007）

It was to optimize the fermentation conditions of neomycin producing by Streptomyces fradiae FIM-S38. The single factor experiments and orthogonal experiments were adopted to optimize the fermentation medium and conditions of FIM-S38 in shake flasks. The constituents of medium, the filling volume of shaking flask, the rotation speed and the temperature were the major factors that affected the yield of neomycin. The composition of glucose 6.0%, soluble starch 3.5%, soybean meal 2.0%, MgSO40.1% and CaCO30.3% was selected to be the medium formula, and the optimal fermentation parameters were as follows：the filling volume 50 mL for a 500 mL shake flask, initial pH at 7.0, shaker’s rotating speed 250 r/min, temperature 35℃, fermentation time 6 d, and the titer of neomycin was 50% higher than that in control.

Streptomyces fradiae Neomycin Orthogonal experiment Fermentation Optimization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.015

2014-05-28

福建省自然科學基金項目（2012J01094）

周璟明，女，碩士，助理研究員，研究方向：微生物藥物；E-mail：15752437@qq.com

張祝蘭，研究員，研究方向：微生物藥物；E-mail：jessylan9963@sina.com