響應面法優化回流提取紫薯花青素工藝

劉倩 齊計英 韓靜 萬閱 鄭士彬

（沈陽藥科大學制藥工程學院，沈陽 110016）

響應面法優化回流提取紫薯花青素工藝

劉倩 齊計英 韓靜 萬閱 鄭士彬

（沈陽藥科大學制藥工程學院，沈陽 110016）

旨在獲得紫薯花青素的最佳提取工藝，采用中心組合（Box-Behnken）試驗設計及響應面分析相結合的方法，對紫薯花青素的回流提取工藝進行優化。單因素試驗結果顯示，最佳乙醇體積濃度為75%、提取溫度為60℃、提取時間為60 min、液料比為7∶1，在此基礎上，利用中心組合（Box-Behnken）試驗設計及響應面分析法進行回歸分析，獲得最優工藝參數為：乙醇體積濃度74%、提取溫度66℃、提取時間56 min、液料比8∶1。在優化后的條件下進行驗證試驗，得到紫薯花青素的提取率為4.64 mg/g，與理論值（4.68 mg/g）相比，相對誤差較小，為0.85%。研究表明，采用響應面法分析優化紫薯花青素的水浴回流提取工藝參數準確可靠，可應用于紫薯花青素的提取生產。

紫薯 花青素 回流提取 中心組合設計 響應面分析

紫薯（purple sweet potatoes，PSP），俗稱黑紅薯，薯肉呈紫色至深紫色，是新近開發出的優良甘薯品種，其肉質紫紅，外觀誘人。其富含蛋白質、淀粉、果膠、纖維素、氨基酸、維生素及多種礦物質，同時還富含硒元素和花青素［1］。紫薯花青素是從紫薯的莖葉或塊根中提取出來的一種水溶性的天然色素，它屬于酚類化合物中的類黃酮類，分子量為287.246，分子式為C15H11O6，基本結構包含一個黃酮母環和一個苯環，黃酮母環上和苯環相連的碳具有手性，因此花青素具有兩種同分異構體。近年的研究表明，紫薯花青素具有清除自由基、抗突變、降低高血壓、減輕肝功能障礙的活性［2-4］。另外，紫薯花青素具有抗炎、抗菌、抗紫外線和減輕記憶缺陷的功能［5，6］。紫薯花青素具有純天然效應和營養功能，應用于食品中安全性高，對人體無害，具有廣闊的市場應用前景。加之紫薯具有其它作物無

可比擬的高產、穩產、適應力強等特點，因此開發紫薯花青素具有很強的原料優勢，紫薯中花青素的應用研究已成為熱點。

響應面法（Response surface methodology，RSM）是以多元二次回歸數學模型為工具，描述相互作用的試驗因子與響應值之間的關系的數據處理方法。響應面法能有效地找到因素間的最優組合，相比于傳統的全因子試驗設計，該法能在更為經濟的試驗次數下，得到精確的統計結果，具有周期短、精確度高等優點。回流提取方法相對于超聲提取、微波提取和超臨界提取等常用提取方法具有操作簡單、溶劑用量少、設備成本低、穩定性好和易于工業化生產等優點。因此，本研究通過單因素試驗和響應面法優化試驗對乙醇體積濃度、提取溫度、提取時間、液料比等因素對紫薯花青素提取率的影響進行研究，分析各因素的變化規律，以期獲得回流法提取紫薯花青素的最佳工藝條件，為紫薯花青素的工業化生產提供基礎研究，以便對紫薯資源進一步開發利用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料及試劑 紫薯：購于沈陽家樂福超市；兒茶素標準品：購于上海江萊生物科技有限公司；濃鹽酸、香草醛、無水甲醇、無水乙醇、丙酮均為國產分析純。

1.1.2 儀器 RRHP-200型萬能高速萬能粉碎機，歐凱萊芙（香港）有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；旋轉蒸發器RE-5299，鞏義市予華儀器有限責任公司；電子天平，常熟市金羊天平儀器廠；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；紫外可見分光光度計，北京普析通用有限公司。

1.2 方法

1.2.1 花青素含量測定 紫薯花青素的測定采用鹽酸-香草醛法［7］。

1.2.2 紫薯花青素的提取工藝 將新鮮紫薯洗凈，經過一定的預處理得到紫薯干粉。準確稱取紫薯干粉5 g，按一定的料液比加入到一定體積濃度的乙醇溶液中，在一定溫度下水浴回流提取一定的時間，真空抽濾后，濾液用真空旋轉蒸發器濃縮至少于50 mL，轉入50 mL容量瓶中并用相同體積濃度的提取劑定容至刻度，得到待測液。

1.2.3 紫薯預處理方式的選擇 紫薯洗凈，按3種方式處理后備用：（1）切片后加鹽脫水、晾干至恒重、粉碎；（2）切片后晾干至恒重、粉碎；（3）切片后放入60℃烘箱中干燥至恒重，粉碎。確定3種處理方式對紫薯花青素提取率的影響。

1.2.4 最佳提取溶劑的選擇 以甲醇、乙醇和丙酮為提取溶劑，確定不同提取劑對紫薯花青素提取率的影響。

1.2.5 單因素試驗 分別考察乙醇體積濃度、提取時間、提取溫度、液料比等因素對花青素提取率的影響。

1.2.6 響應面法試驗設計 根據Box-Behnken試驗設計原理［8］，綜合單因素影響試驗結果，以乙醇體積分數（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）、液料比（D）四因素為自變量，以紫薯花青素提取率為響應值，利用Box-Behnken組合設計試驗方案，并以-1，0，1分別代表變量的因素編碼，變量的因素編碼及水平如表1所示，進行水浴回流提取紫薯花青素條件的優化。采用Design Expert 8.0軟件進行試驗設計。

表1 響應面分析試驗因素水平表

2 結果

2.1 標準曲線

根據所取標準品質量濃度和吸光度數據繪制標準曲線（圖1），經數據處理分析獲得兒茶素標準曲線回歸方程為：y=6.646x+0.020，R2=0.998。

2.2 紫薯預處理方式的確定

由圖2可知，直接晾干比鹽脫水后晾干和烘干的花青素提取率高。因此，采用將鮮樣品切片后晾

干至恒重、粉碎的方法處理紫薯，進一步用于試驗。

圖1 兒茶素標準曲線

圖2 不同處理方法對花青素提取率的影響

2.3 提取溶劑對花青素提取率的影響

由圖3可知，提取溶劑為丙酮的花青素提取率比提取溶劑為乙醇的提取率略高，提取溶劑為甲醇的花青素提取率較低。但乙醇比甲醇、丙酮毒性低，且價格也較之低。所以本試驗選擇用乙醇作為提取溶劑。

圖3 不同提取溶劑對花青素的影響

圖4 各因素對花青素提取率的影響

2.4 單因素試驗結果

2.4.1 乙醇體積濃度對花青素提取率的影響 由圖4-A可知，隨著乙醇體積濃度的增加，紫薯花青素的提取率不斷增加，但當乙醇體積濃度在75%-85%

之間時，花青素提取率沒有太大變化，繼續增加體積濃度比，花青素提取率明顯下降。而乙醇用量過多使得生產成本提高，不利于實際生產應用。因此，最優乙醇體積濃度為75%。

2.4.2 提取溫度對花青素提取率的影響 由圖4-B可知，在一定范圍內，隨著溫度的增加，紫薯花青素提取率隨之升高，到60℃時達到頂峰，但繼續升高溫度，提取效果反而降低。因此，60℃為最優提取條件。

2.4.3 提取時間對花青素提取率的影響 由圖4-C可知，在一定范圍內，隨著提取時間的增加，紫薯花青素提取率隨之升高，到1 h時達到頂峰，而此后若繼續反應，花青素提取率反而降低。因此，60 min為最優提取條件。

2.4.4 液料比對花青素提取率的影響 由圖4-D可知，隨著液料比的增大，紫薯花青素的提取率增加，但當液料比超過一定范圍后，花青素提取率增加的不再明顯。如圖所示，在7∶1-15∶1之間，其花青素的提取率變化不大。出于節省原料以及高的液料比對后續的濃縮工作不便等因素的考慮，7∶1為最優液料比。

2.5 響應面法試驗設計及結果

單因素試驗結果顯示，乙醇體積濃度為75%、提取溫度為60℃、提取時間為60 min、液料比為7∶1時紫薯花青素有最大提取率。紫薯花青素提取的響應面試驗設計方案與試驗結果見表2。

表2 響應面分析試驗設計及結果

2.6 模型方程的建立及顯著性檢驗

根據表2結果計算各項回歸系數，以這些回歸系數建立紫薯花青素提取率與乙醇體積濃度（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）、液料比（D）四個因素的數學回歸模型。回歸方程中回歸系數的估計值見表3。由表2可以得出二次回歸方程式為：紫薯花青素提取率＝4.63-0.072×A+0.11×B-0.035×C+0.17×D+0.034×A×B+0.024×A×C-0.029×A×D-0.046×B×C+0.040×B×D-4.750E-003×C×D-0.30×A2-0.21×B2-0.18×C2-0.27×D2在回歸方程中，B、D變量的正系數表明，該變量的正向變化能引起響應值的增加；A、C變量負系數表明，該變量的正向變化能引起響應值的減少。負的二次項系數表明，方程的拋物面開口向下，具有極大值點，能夠進行最優分析。

回歸模型方差分析（表3）顯示，試驗選用的模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著P=0.092 0＞0.05，說明模型是合適的；模型的校正決定系數R2

Adj=0.927 8，說明該模型能解釋92.78%響應值的變化；相關系數R2=0.963 9，說明該模型擬合程度良好，預測值與實測值之間有較好的相關性，試驗誤差小，可以用回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析和預測。

由表3可知模型的一次項B、D影響極顯著，A影響顯著，C影響不顯著。從F值可以看出，單因素對提取率的影響順序依次是D＞B＞A＞C，即液料比

＞提取溫度＞乙醇體積濃度＞提取時間。交互項影響不顯著，二次項A2、B2、C2、D2影響極顯著，表明各影響因素對提取率的影響不是簡單的線性關系。

表3 響應面回歸模型的方差分析

2.7 響應面交互作用分析與工藝優化

對乙醇體積濃度（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）、液料比（D）四因子，兩兩作交互作用分析，對其作響應面圖，分別見圖5-圖10。

圖5 乙醇體積濃度和提取溫度的響應曲面和等高線圖

等高線的形狀反映交互效應的強弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則表示兩因素交互作用顯著。圖7-圖10中等高線呈橢圓形，故乙醇體積濃度和液料比兩因素之間、提取溫度和提取時間兩因素之間、提取溫度和液料比兩因素之間、提取時間和料液比兩因素之間交互作用顯著。

在求取最優提取條件時RSM能夠綜合考慮各因素對2個響應值不同的影響程度及趨勢進行綜合評價。可得最佳工藝參數為：乙醇體積濃度74%、提取溫度66℃、提取時間55 min、液料比8∶1，在此優化條件下，花青素的提取率的理論值為4.68 mg/g。為了進一步驗證響應面分析法的可靠性，采用上述最優條件進行花青素提取，重復3次，測得紫薯花青素提取率分別為：4.64、4.65和4.64 mg/g，取平均值為4.64 mg/g，與理論值相比，相對誤差較小，為0.85%。因此，采用響應面法分析優化得到的紫薯花青素水浴回流提取的參數準確可靠，可用于實際操作。

3 討論

本研究首先確定了紫薯的預處理方式和提取溶劑的選擇，以花青素提取率為指標，對提取過程中影響花青素提取的乙醇體積濃度、提取溫度、提取時間和液料比4個因素，首先進行單因素試驗考察，再采用中心組合（Box-Behnken）試驗設計及響應面分析，建立回歸模型。通過分析各因素的顯著性和交互作用，優化得到紫薯花青素回流提取的最優工藝參數。

紫薯預處理方式的確定試驗結果顯示，直接晾干比鹽脫水后晾干和烘干的花青素提取率高。出現這種情況的原因可能是花青素存在于細胞的液泡中，

可能在鹽脫水過程中破壞了細胞，使花青素溶出細胞外，在空氣中氧化，而導致含量降低；加熱會部分破壞花青素，并且烘干消耗大量的熱能，成本較高。在提取溶劑的選擇試驗中，提取溶劑為丙酮的花青素提取率比提取溶劑為乙醇的提取率略高，提取溶劑為甲醇的花青素提取率較低。實際生產中，用乙醇代替了許多常用的溶劑，如甲醇、丙酮、乙醚，因為這些試劑有毒性，不利于粗提取物在食品和藥品中的進一步利用［9］，另外，乙醇能以任意比例與水互溶，能有效溶解花青素，提取液易于保存，過濾、回收和安全性也比較高，溶劑殘留現象不突出。所以本試驗中乙醇可作為提取溶劑的最佳選擇。

圖7 乙醇體積濃度和液料比的響應曲面和等高線圖

圖8 提取溫度和提取時間的響應曲面和等高線圖

單因素試驗中，乙醇體積濃度、提取溫度和提取時間的變化趨勢，提取率先升高然后下降。溫度

的升高，有利于增加乙醇的滲透能力，致使溶劑化的花青素從細胞內向外的擴散能力也增加，使得提取率升高；繼續提高溫度，紫薯花青素會發生熱降解，其結構向查耳酮轉變，導致有色結構2-苯并吡喃鹽和醌式假堿減少［10］，提取率降低。在一定時間內，花青素隨時間的延長而不斷被溶解出，提取時間愈長，提取率越高，但擴散達到平衡后，細胞內外濃度達到動態平衡，故隨著時間再延長提取率無明顯變化；時間過長，由于花青素在加溫溶液中穩定性可能隨時間變化，因此提取時間的繼續延長，花青素因氧化分解反而使含量降低［11］，因此，提取率降低。隨著液料比的增大，紫薯花青素的提取率增加，但當液料比超過一定范圍后，花青素提取率增加的不再明顯。這是因為對于一定量的紫薯粉末來說，溶劑用量的增加降低了溶劑中花青素的濃度，增加了原料與溶劑接觸界面的濃度差，從而提高了花青素與溶劑的擴散速度，提取率增大；但是當達到一定比例時，溶液中花青素的濃度達到平衡濃度，提取率就不再升高，甚至可能會減少，因為溶劑用量過大，顆粒細胞內的蛋白質等物質析出，反而不利于花青素的溶出，從而造成提取率的下降。

圖9 提取溫度和液料比的響應曲面和等高線圖

圖10 提取時間和液料比的響應曲面和等高線圖

4 結論

采用Box-Behnken的中心組合設計及響應面（RSM）分析，建立紫薯花青素色素提取的二次多項式數學模型。經檢驗證明該模型是合理可靠的，能夠較好地預測薯花青素提取率。利用模型的響應面及其等高線，對影響薯花青素提取率的關鍵因素及其相互作用進行探討，通過典型分析并考慮到實際操作的便利性得到的最終優化工藝參數為乙醇體積濃度74%、提取溫度66℃、提取時間55 min、液料比8∶1，在此優化條件下，花青素的提取率的理論值為4.68 mg/g。為了進一步驗證響應面分析法的可靠性，采用上述最優條件進行花青素提取，重復3次，測得紫薯花青素提取率分別為：4.64、4.65和4.64 mg/g，取平均值為4.64 mg/g，與理論值相比，相對誤差較小，為0.85%。因此，采用響應面法分

析優化得到的紫薯花青素水浴回流提取的參數準確可靠，可用于實際操作，能有效減少工藝操作的盲目性。

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（責任編輯 馬鑫）

Optimization of Refluxing Extraction Technology of Anthocyanins from Purple Sweet Potato by Response Surface Method

Liu Qian Qi Jiying Han Jing Wan Yue Zheng Shibin
（School of Pharmaceutical Engineering，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016）

Response surface methodology（RSM）was used to optimize the refluxing extraction process of anthocyanins from purple sweet potatoes as a result of getting the optimum technology. The results of single-factor test showed that the best ethanol concentration was 70%, extraction temperature was 60℃, extraction time was 60 min, liquid-material ratio was 7∶1. Based on these results, the significant parameters were further optimized using Box-Behnken design, RSM and regression analysis. The optimum parameters were：ethanol concentration 74%, extraction temperature 66℃, extraction time 56 min, liquid-material ratio 8∶1. Under such conditions, the extraction efficiency could reach 4.64 mg/g, and have a smaller relative error at 0.85% compared with the theoretical value（4.68 mg/g）. The study showed that the processing parameters achieved from these experiments were accurate and can be applied to the extraction and production of anthocyanins from purple sweet potatoes.

Purple sweet potatoes Anthocyanin Refluxing extraction central Composite design Response surface methodology

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.016

2014-05-12

劉倩，女，碩士，研究方向：天然活性物質的提取與制劑研究；E-mail：18604019826@163.com

韓靜，女，博士，研究方向：天然活性物質分離提取應用研究，納米技術制藥與工程研究；E-mail：HJ-8080@163.com