玉米彎孢葉斑病菌REMI白化突變體的篩選與致病性測定

夏淑春王學武張茹琴鄢洪海

（1. 青島農業大學農學與植物保護學院，青島 266109；2. 青島市植物保護站，青島 266100）

玉米彎孢葉斑病菌REMI白化突變體的篩選與致病性測定

夏淑春1王學武2張茹琴1鄢洪海1

（1. 青島農業大學農學與植物保護學院，青島 266109；2. 青島市植物保護站，青島 266100）

旨在探討玉米彎孢葉斑病菌致病機制及遺傳變異特性，利用限制性內切酶介導的基因整合技術（REMI）對Curvularia lunata進行了遺傳轉化，共獲得109個穩定的突變株。PCR檢測結果表明，質粒pUC-JS已成功導入突變株中，轉化子既有單拷貝也有多拷貝，白化菌株單拷貝插入頻率為40%。此外，白化玉米彎孢葉斑病菌REMI突變株菌落顏色與野生菌株差異明顯，并且在致病性上也明顯弱于野生菌株；質粒拯救、測序與blast分析推測插入可能導致FAD3基因功能喪失。

玉米彎孢菌葉斑病菌 REMI 白化菌株 致病性

我國是玉米生產大國和消費大國，產業鏈長，年度間的豐產與歉收對國家糧食安全和人民生活都有重要影響。然而，近年來玉米彎孢葉斑?。跜urvularia lunata（Wakker）Boed.］危害嚴重，1996-2001年，連續幾年該病害大發生，僅遼寧省1996年發生面積就達16.8萬hm2，嚴重地區減產50%以上，有1.6萬hm2玉米絕產［1，2］。雖然近幾年該病害發生有所減輕，但個別地區仍造成嚴重損失［3，4］。據報道，玉米彎孢葉斑病菌自然條件下經常有菌株白化現象，并且白化菌株致病性出現變異［5］。

在植物病原真菌中，Lu（1994）首先用REMI插入突變成功標記了玉米小斑病菌（Cochliobolus heterostrophus）Tox1毒素基因位點，隨后，該實驗室利用質粒拯救的方法克隆了突變基因，即線性聚乙酮醇（linear polyketide）合成酶的基因——PKS1，該酶是T-毒素合成所必需的。Tanaka等（1999）

從日本香梨黑斑病菌Alternaria alternata的984個REMI轉化體中鑒定出了3個不能致病，并喪失產生AK-毒素的突變體，分離出了參與AK-毒素生物合成途徑的兩個基因AKT1和AKT2［6］。目前REMI技術已經廣泛應用于真菌尤其是植物病原真菌的研究，并因其高效性已成為植物病原真菌研究中的一種重要手段。本研究利用限制性內切酶介導整合（REMI）技術對該病菌進行遺傳轉化，旨在探討玉米彎孢葉斑病菌致病機制。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米彎孢葉斑病菌菌株LZ-1（采自山東萊州）由本實驗室提供，玉米自交系黃早四由青島農業大學遺傳研究室惠贈。質粒pUC-JS 由筑波大學植物病理研究室惠贈（包含一個潮霉素磷酸轉移酶抗性基因hph），有Hind Ⅲ、BamH I、Xab I、Kpn I等多種限制性酶等單酶切位點。

1.2 方法

1.2.1 REMI突變體的制備

1.2.1.1 玉米彎孢葉斑病菌原生質體的制備 玉米彎孢葉斑病菌原生質體制備參考張建萍等［7］方法，并作適當修改。1 g菌體加入25 mL pH7.0緩沖液，再加入5%的DTT，放置搖床上慢速振蕩30 min，然后用DF液離心洗滌兩次，吸除上清，加入5 mL高滲緩沖液制成懸浮液（1 mL懸浮液加入4 mL STC液：0.7 mol/L 山 梨 醇、Tris-HCl（pH7.5）10 mL、CaCl21.11 g、ddH2O補平至1 000 mL），然后加入4 g/L細胞壁降解酶于80℃，80 r/min振蕩4 h，形成原生質體，用500目尼龍篩過濾，濾液2 000 r/min離心去除酶液，用STC液洗滌兩次，最后加入5 mL STC液制成原生質體懸浮液。

1.2.1.2 質粒提取及線性化 質粒pUC-JS轉化 E. coli 菌株DH5α，質粒提取和 Hind Ⅲ、BamH I和Kpn I酶切參考Akamatsu等［8］方法，略做改進。

1.2.1.3 菌株基因組DNA提取 采用CTAB法提取玉米彎孢葉斑病菌基因組DNA，具體參照George等［9］的方法進行。

1.2.1.4 REMI轉化 REMI轉化方法參考李波等［10］和張建萍等［11］方法，略加改動。在50 mL離心管中加入線性質粒40 μg、濃度為10 U/μL限制性內切酶 Hind Ⅲ 10 μL、STC液200 μL，配制成酶-質?；旌弦海缓笙螂x心管中加入100-200 μL原生質體懸浮液，并使其與酶-質?；旌弦夯靹颍帽?5-20 min，緩慢向管中加入2 mL 60% PEG，冰浴20-25 min，然后將離心管取出在28℃下放置10-20 min，加入 5 mL預冷的STC液，4℃下4 000 r/min離心15 min，棄上清液，加入3 mL再生培養液，30℃下放置6 h。將培養液倒入培養皿中，然后加入約15 mL預先熔化好的，并且冷卻至50℃左右的固體再生培養基，邊搖晃邊加入潮霉素至濃度為300 μg/mL，在培養基表面鋪滿一層為止，每個平板約需10 mL，在28-30℃下，培養4-5 d，將能夠抗潮霉素的菌落轉移到預先倒好的含有潮霉素250 μg/mL的固體PDA培養基上進行2次篩選，獲得玉米彎孢葉斑病菌突變株。

1.2.2 玉米彎孢葉斑病菌REMI突變株鑒定

1.2.2.1 突變株的穩定性測定 將2次篩選后獲得的轉化體轉接至不含潮霉素的PDA上，28℃下培養，待長出菌落后，繼續轉接到不含潮霉素的PDA上，重復7次，再轉接到含有潮霉素的PDA上觀察培養。

1.2.2.2 突變株的PCR檢測 根據抗潮霉素基因序列設計合成引物（大連寶生物公司）：hph1上：5'-ATGAAAAAGCCTGAACTC-3'；hph2下：5'-CTATTCCTTTGCCCTCGG-3'。

PCR擴增程序：95℃變性5 min；94℃變性1 min，54℃退火0.5 min，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min。程序結束后擴增產物用0.8%瓊脂糖電泳檢測。

1.2.2.3 轉化子的Southern blot檢測 隨機挑選5個轉化子，以野生型菌株LN-1作為對照，大量法提取轉化子和野生型菌株的基因組DNA，用潮霉素磷酸轉移酶基因作為探針，Hind Ⅲ酶切轉化子和野生型菌株DNA，用Hind Ⅲ酶切的λDNA作為Marker進行Southern blot驗證［12］。

1.2.3 轉化子生物學測定 選取白化突變株和野生菌株于PDA培養基（均為培養皿直徑9 cm，10 mL基質）上培養7 d，測定菌落直徑、比較相對產孢量（刮取培養皿中菌體，加入20 mL蒸餾水計算孢子濃度），并進行培養性狀觀察和生長發育性狀檢測；另

外，選取轉化子接種生長至13葉期的玉米自交系黃早四植株，孢子懸液濃度為106個/mL（含有0.02% Tween20和2%蔗糖溶液），以相同濃度和相同處理的野生菌株（LN-1）為對照。噴霧接種后保濕培養24 h，然后轉入正常管理，接種后7 d進行發病情況調查，評價轉化子的致病性。

1.2.4 質粒拯救 參照李鐵民等［13］方法。提取突變體LN-1-A的DNA，利用SacⅠ消化5-10 μg的DNA，37℃過夜，第二天觀察消化的彌撒程度，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提純化DNA，于8 000 r/min、4℃下離心10 min，取上清液于另一干凈的離心管中，加入1/10體積的3 mol/L NaAc（pH5.2）和70%的乙醇漂洗。溶解DNA于50-100 μL TE中，加100 μL的連接體系（T4 DNA連接酶），16℃溫室過夜。65℃處理10 min，滅活。在連接好的DNA體系中加入1/10 體積的NaAc和2倍體積的無水乙醇冰浴沉淀4 h，14 000 r/min離心20 min，去上清，用70%的乙醇漂洗，抽干后溶解于5 μL水中。將樣品稀釋5-10倍后，取1-2 μL于20-25 μL已經制備好的感受態細胞（DH5α）中，利用Gene Pulser進行電激轉化，參數為電壓1.7 kv，時間為5.3 ms。將電激后的細胞混入800 μL的SOC中，37℃下振蕩培養1 h（80-100 r/min），取出后在含Amp（100 μg/mL）的LB平板上涂勻后，37℃下培養過夜，從平板上挑出長出的克隆點，在含Amp的LB培養基中搖菌提取質粒，電泳檢測后測序（上海捷瑞公司）分析。

2 結果

2.1 原生質體制備及純化條件的確定

試驗表明采用改良Fries培養基最有利于原生質體的制備，在6、12、24和36 h提取原生質體檢驗中，以24 h原生體的產量最高，為3.52×105個，36 h時檢測結果顯示原生體的數量下降，為0.52×105個，說明菌齡對原生質體制備有影響。細胞壁降解酶的種類及濃度可采用溶壁酶、崩潰酶、蝸牛酶和纖維素酶1∶1∶1∶1混合液，酶解6 h達到原生體數量高峰，10 h開始下降，超過一定時間原生質體開始萎縮，且數量逐漸減少，采用三層擦鏡紙過濾后，用STC液洗滌后獲得需要的玉米彎孢葉斑病菌原生質體。

2.2 原生質體的再生

在玉米彎孢葉斑病菌（LN-1）菌絲加入裂解酶破壞細胞壁釋放原生質體過程中，原生質體隨著釋放時間長短體積變化較大，最初開始釋放時體積相對較小，隨著其在滲透液中時間的延長，體積逐漸變大，原生質體呈多角形，其平均直徑約為70 μm。為了確定原生質體活性，將得到的原生質體在0.7 mol/L的山梨醇為穩定劑的再生培養基上進行培養，結果顯示玉米彎孢葉斑病菌LZ-1的原生質體再生情況良好，經過重復試驗得到其再生率達到 30%，可滿足REMI轉化要求。

2.3 質粒的提取和檢測

通過試劑盒提取質粒 DNA，并用其單一酶切位點 Hind Ⅲ對其進行酶切，通過電泳檢測其分子量。酶切后得到的DNA分子量略大于5 000 bp，與 pUCJS 給出的圖譜5 080 bp相一致，圖上僅出現一條帶可以判斷質粒DNA 酶切已經完全，僅以線性的形態存在，并沒有 RNA 或是染色體 DNA 的污染。質粒純度檢測為 OD260/OD280＝1.8-2.0，質粒濃度為47.54 μg/μL，濃度和純度可滿足 REMI 轉化的要求。

2.4 REMI遺傳轉化和轉化子的獲得

在150 μL原生質體懸浮液中加入5 μg酶切質粒和45 U限制性內切酶在聚乙二醇（PEG）存在的條件下冰浴，即可將線性的質粒插入到原生體的染色體DNA上。將轉化子在含200 μg/μL 潮霉素的PDA培養基上連續培養5代，都能持續生長，說明潮霉素基因在轉化子中穩定表達，初步確定轉化成功。經過多次REMI誘導轉化，最終獲得109個REMI轉化子，其中包含5個白化突變株。白化突變體的菌落與野生黑色菌株差異明顯，菌絲細胞壁較為透明，菌絲相對細小，產孢數量變少。

2.5 突變體的檢測

2.5.1 突變體穩定性的檢測 隨機選取10個轉化子在不含有潮霉素的PDA培養基上連續培養7代后，再經過第二次用含有200 μg/μL 潮霉素的PDA培養基篩選時，所有轉化子都可以正常生長，因此可以初步認為該109個轉化子即為 LN-1的REMI 轉化突變株。5個白化突變株經過繼代培養后也證明是穩

定遺傳的REMI轉化子。圖1顯示，在PDA培養基中培養7 d，轉化子LN-1-A和LN-1-B菌落顏色呈灰白色至白色，與野生菌株黑色差異顯著，并且生長速度也有明顯差異，一些菌絲的細胞壁較透明，只有少數色素積累，初步確定為黑色素合成途徑被阻斷突變體。

圖1 野生菌株與部分轉化子菌落形態

2.5.2 轉化子PCR檢測 以野生玉米彎孢葉斑病菌LN-1基因組DNA和5個白化轉化子基因組DNA作為模板，利用抗潮霉素基因序列設計引物進行PCR擴增。結果（圖2）顯示，所有的轉化子都擴增出目的條帶，以抗潮霉素基因的引物1和2進行 PCR擴增時，與陽性對照pUC-JS（CK）相同，所有轉化子的特異帶都出現在510 bp，而出發菌株LN-1沒有出現特異性條帶。

圖2 利用hph引物對質粒pUC-JS插入LN-1的PCR 檢測

2.5.3 轉化子Southern blot檢測 選取5個轉化子，以潮霉素基因作為探針，進行Southern blot檢測，雜交結果顯示5個轉化子都至少有一條雜交帶，并在5.0 kb處，再次證明質粒pUC-JS（CK）已經插入到LN-1染色體中。

Southern雜交的5個轉化子中，2個為單拷貝插入。在單拷貝轉化子中，1個菌株的雜交帶比目的條帶小，1個雜交帶比目的條帶大。在3個多拷貝插入的轉化子中，都有2個條帶，說明質粒pUC-JS在LN-1染色體上可有2個不同的基因插入位點。

2.6 突變體的生物學性狀研究

2.6.1 突變體菌株生長速度的測定 對轉化子LN-1-A、LN-1-B和LN-1-C進行生長量測定，結果（圖3）發現突變菌株的生長速度（菌落直徑）與野生菌株差異不顯著，但是菌絲形態和菌落密度與野生菌株有明顯差異，轉化子菌絲一般都較纖細、透明，菌落中菌絲疏松，無黑色素和其它色素產生，而野生菌株除有黑色素產生外，還可以產生一些棕黃色素。

圖3 轉化子及野生菌株生長速度曲線

2.6.2 突變體菌株產孢量的測定 對供試玉米彎孢葉斑病菌野生菌株LN-1及部分轉化子產孢量測定結果表明，野生菌株和轉化子的產孢量存在明顯差異。圖4顯示，轉化子LN-1-A和LN-1-B與野生菌株比，產孢量明顯減少，而LN-1-C轉化子比野生菌株的產孢量還有所增加，說明插入片段影響了玉米彎孢葉斑病菌的發育。

圖4 轉化子產孢量測定

2.6.3 突變體菌株致病性檢測 為檢測 REMI 轉化子（白色突變株）的致病性，選擇 REMI 轉化子 LN-

1-A、LN-1-B、LN-1-C和野生菌株LN-1分別接種相對感病的玉米自交系黃早四，致病性測定結果（圖5）表明，轉化子的致病性比野生菌株LN-1的致病性明顯減弱，菌株LN-1-A、LN-1-B、LN-1-C只在玉米葉片上形成幾個零星的褐色小斑點。

圖5 白色菌株和野生菌株接種黃早四后葉片癥狀

2.7 突變基因克隆

2.7.1 質粒拯救 利用ScaⅠ酶切突變體LN-1-A、LN-1-B基因組DNA，之后利用T4連接酶連接，進行質粒拯救。由于ScaⅠ在介導酶HindⅢ的對側，因此拯救出的質粒應該去除了含有抗潮霉素基因（hph）。故在克隆體篩選過程中使用抗氨芐青霉素（Amp）作為抗性選擇標記，而所得克隆體質粒3.3 kb（圖6），說明載體攜帶了部分的外源基因。

圖6 質粒拯救后質粒提?。ˋ）和酶切（B）鑒定

2.7.2 測序與blast分析 拯救的質粒是載體pUCJS連接了一段外源基因的質粒，在利用Amp作為引物對拯救質粒進行基因測序后，經過與pUC-JS的序列比對，測定得到外源序列如圖7所示，共427 bp。對該序列進行blast分析顯示，其與不飽和脂肪酸脫氫酶（FAD3）具有高度同源性。

圖7 外源序列

3 討論

據報道，在真菌遺傳轉化中，利用限制性內切酶和線性化質粒方法，可提高其轉化效率［14，15］。本研究采用REMI方法，并通過最佳限制性內切酶種類和濃度的選擇，獲得了玉米彎孢葉斑病菌較適宜轉化條件：用3 μg的線性化質粒和40 unit Hind Ⅲ加入到 150 μL原生質體里面，濃度為1×107/mL。采用該方法共獲得109個轉化子，其中有5個轉化子為白色菌株，致病性明顯減弱，與傳統的微生物誘變技術相比，明顯提高了轉化效率和轉化子單拷貝頻率。

本研究在所獲得的REMI 轉化子中發現致病性減弱與白化現象相關，即菌株白化可能導致病菌致病性減弱，這與鄢洪海等［5］報道相一致。鄢洪海等在遼寧省調查采集玉米彎孢葉斑病樣本時，發現了玉米彎孢葉斑病菌白化現象，并在致病性測定時發現了白化菌株致病力較野生黑色菌株弱的特性。通過REMI遺傳轉化玉米彎孢葉斑病菌獲得白化菌株轉化子，并通過致病性測定進一步證明了玉米彎孢葉斑病菌這一特性，為以后玉米彎孢葉斑病菌致病機制研究奠定了基礎。

通過質粒拯救的方法克隆到了一個與不飽和脂肪酸脫氫酶（FAD3）具有高度同源性的一段基因序列。許多研究表明，不飽和脂肪酸的含量在高等植物抗性中有重要生理功能，它們不僅提供了大

量保守自由能，而且能影響應答各種環境信號的作用［16-18］。ω-3脂肪酸脫飽和酶是不飽和脂肪酸合成途徑中催化脂肪酸轉化的關鍵酶，在模式植物擬南芥中人們根據定位差異將該酶進行分類，FAD3基因編碼內質網型ω-3脂肪酸脫飽和酶，FAD3在常溫下表達［19］。另外，在曲霉菌中，刪除一個編碼脂肪酸飽和酶基因后，就能阻礙脂肪酸的合成，同時拖延了孢子和菌絲的合成［20］。然而，目前尚不明確不飽和脂肪酸脫氫酶基因（FAD3）與菌株白化及弱致病現象的直接遺傳關系，需要今后利用基因敲除或基因沉默等方法進一步研究。

4 結論

本研究采用限制性內切酶介導整合方法（REMI）獲得了玉米彎孢葉斑病菌遺傳轉化子，其中既有單拷貝也有多拷貝轉化子。在轉化子中有一部分是白色突變體，也有野生色突變體，說明插入位點不只是一個，至少存在2個以上插入位點。而玉米彎孢葉斑病菌白色突變體致病性普遍減弱，說明菌株色素合成與其致病性關系密切。

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（責任編輯 馬鑫）

Bending Spore of Corn Leaf Spot Fungus REMI Albino Mutant Screening and Determination of Pathogenic Transformation

Xia Shuchun1Wang Xuewu2Zhang Ruqin1Yan Honghai1
（1. College of Agronomy and Plant Protection，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109；2. Qingdao Plant Protection Station，Qingdao 266100）

To investigate bending spore corn leaf spot fungus pathogenic mechanism and genetic variation characteristics, this study using restriction enzymes mediated gene integration technology（REMI）of Curvularia lunata genetic transformation, received 109 stable mutant strains. PCR detection results showed that the plasmid pUC-JS has successfully imported mutant strains, into the son has both single copy and copy, albino strain single copy insert frequency was 40%. In addition, an albino corn bending spore bacteria leaf spot REMI contrast with wild strain of the mutant strains colony color, and also significantly weaker than wild on pathogenic strains. Plasmid save, sequencing and analysis of blast speculated that inserts may result in the loss FAD3 gene function.

Curvularia lunata REMI Albino mutant Pathogenic

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.018

2014-06-05

山東省科技發展項目（2009GG10009022），山東省自然科學基金項目（ZR2011CL005），山東省“泰山學者”建設工程專項經費資助項目（BS2009NY040）

夏淑春，女，副教授，研究方向：植物有害生物綜合治理；E-mail：xiashuchun@163.com

鄢洪海，男，博士，教授，研究方向：植物病理生理與分子生物學；E-mail：hhyan@qau.edu.cn